蓝莓叶多酚研究进展及其在食品中的应用
摘要：多酚是一种植物次生代谢物，包括花色苷类、黄酮类、黄酮醇类、酚酸等成分，其结构多样，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、预防心血管疾病等多种生物活性。蓝莓，又称越桔，属于杜鹃花科，越橘属植物，常绿或落叶灌木。蓝莓叶全绿或有锯齿，可以药食两用。近年来，蓝莓叶因多酚类物质含量高而倍受关注，蓝莓叶多酚具有多种生理功能逐渐成为天然产物化学研究的热点。本文综述了蓝莓叶多酚的提取技术、分离纯化技术、多酚总量的测定方法、组成分析与结构鉴定、生物活性，开发利用并展望了其发展前景。蓝莓叶多酚是值得研究与开发的天然植物成分。
关键词：蓝莓叶多酚；提取；纯化；生物活性；研究进展
中图分类号：TS202.3文献标识码：A文章编号：1674-506X（2013）06-0099-0005
蓝莓，又称越桔、乌饭树、南烛等，属于杜鹃花科，越橘属植物，是常绿或落叶灌木。我国有着丰富的蓝莓资源，分布于全国各地，主产于西南、华南和东北，大兴安岭是中国蓝莓产量最多的地方，丰年蓝莓果产量数十万吨至百万吨。蓝莓叶片互生，纸质，椭圆形至长圆形，长1-2.8cm，宽0.6-1.5cm，顶端圆形，基部宽楔形或楔形，全绿，可以药食两用。蓝莓叶中含有粗蛋白、粗纤维、脂肪酸、甾醇、萜类、矿质元素、氨基酸、有机酸、维生素、糖类和大量多酚类化合物。多酚，又名单宁、鞣质，是一类广泛存在于植物体内的次生代谢物质的混合物，是分子中具有多个羟基酚类植物成分的总称，表现出强大的抑酶性和抑菌性，多酚包括花色苷类、黄酮类、黄酮醇类、酚酸等［1］。蓝莓中的多酚类化合物是一种重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗溃疡、抑菌、改善血液循环、生物防御等生物活性［2］。近年来随着现代分析和分离技术的发展与应用，对蓝莓叶多酚的研究逐步深入，本文综述了蓝莓叶多酚的研究进展情况，为更好的研究和开发利用蓝莓叶资源提供思路。
1·蓝莓叶多酚的提取
多酚类物质的传统提取方法是溶剂提取法，这种技术较成熟、不需要特殊的仪器、应用也较为普遍，但溶剂提取法提取时间长、样品部分损失、安全性低。为了解决传统方法中的不足，近年来一些准确度高、快速简单的提取方法迅速发展起来，如超声波提取法、微波提取法、酶法、超临界流体萃取法等。溶剂提取法主要是根据植物中有效成分在溶剂中的溶解作用，选择对有效成分溶解度大，对不需要成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从植物组织内提取出来，一般分为渗透、溶解、扩散等过程［3］，常用的溶剂有水、乙醇水溶液、甲醇水溶液、乙酸乙酯等。余清等［4］采用溶剂提取法提取蓝莓叶中总黄酮，并用响应面法对提取条件进行优化，发现在提取前浸泡60min，液料比50∶1（mL/g），提取温度61℃，提取时间2h，乙醇浓度87%，蓝莓叶黄酮提取率可达68.12%。
微波提取技术是指溶剂在微波反应器中从天然植物组织中提取有效化学成分的方法，通过利用微波场的生物效应、热效应及“扰动”来加速物质的的扩散溶解，有效提高化合物的提取得率［5］。刘小莉等［6］采用微波技术提取蓝莓叶中总黄酮，最佳工艺条件为微波功率500W，微波提取时间50s，固液比1∶60（g/mL），乙醇浓度70%，蓝莓叶总黄酮得率（30.187mg/g）显著高于直接水浸提法（13.415mg/g）。张玉香等［7］也采用微波技术与响应面方法确定蓝莓叶黄酮的最佳提取工艺条件：提取温度72℃，乙醇体积分数64%，微波功率456W，此工艺条件下黄酮提取率为4.232%。
超声波提取技术指利用频率高于20kHz的声波，通过超声波辐射压强产生的机械效应、空化效应和热效应加快物质的扩散溶解，有效提高化合物提取的得率和含量［5］。顾文秀等［8］采用超声波技术提取乌饭树叶色素，最佳工艺条件为超声波频率30kHz，浸提时间10min，乙醇体积分数62%，料液比1∶3.5（g/mL），超声波提取法提取率（23.84%）显著高于常规溶剂提取法提取率（11.43%）。
酶法提取主要是通过酶解使细胞壁软化、膨胀及崩溃，促进有效成分溶出。余清和陈绍军［9］采用纤维素酶和果胶酶对乌饭树叶色素的提取工艺进行了探讨，结果表明纤维素酶与果胶酶配比2∶1，酶解时间3h，提取时间3h，酶法提取与传统的有机溶剂提取相比，色素的提取率提高了13.2%。酶法提取对酶解温度和溶液的pH值有较严格要求，温度和pH值超过一定范围，酶就会失去活性。
超临界流体萃取技术是近30年来发展起来的一种新兴技术，它以超临界状态下的流体作为溶剂，利用该状态下流体所具有的高渗透能力和高溶解能力萃取分离混合物的过程［10］。人们较多选用无毒的CO2流体作为超临界流体，在茶多酚的提取中应用较广泛［11］。余清等［12］采用CO2超临界萃取技术对乌饭树叶总黄酮的提取工艺进行了研究，最佳萃取压力为18MPa，萃取温度为50℃，萃取时间为1.5h，夹带剂乙醇浓度为75%，CO2流量为20kg·h-1，夹带剂添加量为5mL·g-1，此条件下乌饭树叶总黄酮平均提取率为73.10%。
2·蓝莓叶多酚的分离纯化
多酚的分离纯化方法有薄层色谱法、传统的柱层析法、高效液相色谱法等。薄层色谱法设备简单、成本低、操作方便、分离速度快，已成为一般实验室必不可少的分离多酚的方法［13］，缺点是其分离多酚组分不多且定量不够准确。高效液相色谱法是实验室应用最广泛、最有效的分离分析方法之一，具有分辨率高、重复性好、分析速度快、定量分析精确度高等优点，并可用作实验室小量色谱纯样品的制备，已被广泛应用于食品中多酚类化合物等非挥发性成分的分离。传统的柱层析法是通过在玻璃柱添加填料对被分离物质吸附分离。目前柱层析法多用于多酚的初步纯化，常用的填料是大孔树脂。大孔树脂是一种具有多孔立体网状结构，与其他吸附剂相比，具有成本低、稳定性好，容易再生等特点，在天然物质分离中被广泛使用。大孔树脂法也是初步纯化多酚常用的方法。李颖畅等［14］用AB-8型大孔树脂对蓝莓叶多酚进行初步纯化，蓝莓叶多酚上样浓度为1mg/mL，吸附流速为1mL/min，蓝莓多酚上样量达到150mL出现泄漏，解吸流速为1mL/min，5倍柱床体积的50%乙醇作为洗脱液，蓝莓叶多酚纯度为74.16%，回收率为85.47%。王立［15］采用聚酰胺柱分离纯化蓝莓叶黄酮，不同浓度乙醇梯度洗脱，分离得到5种黄酮组分。李增亮［16］先用大孔树脂对蓝莓叶提取物进行初步纯化，收集70%乙醇洗脱组分，再采用硅胶柱色谱氯仿-甲醇（1∶0-5∶5）为溶剂梯度洗脱，得到5个流分，再经反复的硅胶柱色谱，SephadexLH-20分离纯化，得到12种组分。
3·蓝莓叶多酚总量的测定方法
Folin-Ciocalteu法根据多酚类化合物在碱性条件下能与Folin-Denis试剂生成蓝紫色的化合物，一般以没食子酸为标准品，此方法能测定多酚的总量，国际上测定植物酚类常用此方法，但是蛋白质、抗坏血酸对其有干扰［17］。
高锰酸钾滴定法根据多酚类物质能与氧化剂高锰酸钾起氧化还原反应，用靛红做指示剂，根据换算常数和滴定消耗的高锰酸钾计算多酚含量，此方法缺点是终点不敏锐和不易掌握，误差较大。酒石酸铁比色法此法基于一定的pH值下，多酚类与酒石酸铁生产紫褐色的络合物，其含量与络合物的吸光度成正比，通过标准品的标准曲线或经验系数换算求其含量［18］。李颖畅等［14］和刘曦［19］等以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu法测定蓝莓叶总多酚含量，蓝莓叶多酚与Folin-Denis试剂生成的络合物稳定性好，无沉淀生成，适合测定蓝莓叶多酚总量。王立等［20］对多酚中黄酮类物质含量测定方法进行了研究，以芦丁为标准品，分别采用NaNO2-Al（NO3）3比色法和AlCl3比色法测定蓝莓叶黄酮总量，发现AlCl3比色法更适合蓝莓叶总黄酮含量测定。Hicks等［21］采用NMR分光光度法对蓝莓叶中绿原酸和金丝桃苷进行定量测定，并与高效液相色谱测定方法进行了比较，发现两种测定方法测定蓝莓叶中绿原酸和金丝桃苷并没有显著的不同。
4·蓝莓叶多酚的组成分析和结构鉴定
常用于多酚物质组成分析和结构鉴定的方法有颜色反应、紫外-可见光谱法、高效液相色谱、高效液相色谱-质谱联用、核磁共振等技术，一般情况是几种方法联合使用。多酚的鉴定首先从多种成分中分离出多酚纯样品，尤其是质谱和核磁共振分析，核磁共振需要纯样品量较大，而质谱仅需要少量甚至微量样品。自从1935年日本学者harukitiNakamura从蓝莓叶中分离出槲皮素以来，JaninaKaminska［22］分离出槲皮素、扁蓄甙、芦丁。Matsuo等［23］对兔眼蓝莓的叶片化学成分进行了详细分析，主要成分为咖啡酰奎尼酸、黄酮苷、黄烷-3-醇、原花青素。王立［15］对柱层析分离的5种成分采用颜色反应、紫外光谱扫描、质谱、核磁共振波谱等分析相结合，鉴定出槲皮素、白杨黄素、芹黄素、山奈酚和木犀草素5种成分。李增亮［16］采用核磁共振技术鉴定了蓝莓叶提取物中12种组分。
5·蓝莓叶多酚的生物活性
多酚对人类健康的有益作用已经有目共瞩，这促进功能性食品开发利用。天然多酚类化合物的生物活性很多是基于它的抗氧化活性，如抗衰老、提高自身免疫力、抗炎症、防止心血管疾病等［24-26］。多酚的抗氧化活性也能对其癌症的预防作用作出部分解释［27］。在很多年以前，人们就用蓝莓叶的汁液作为防腐剂用在米饭、蛋糕等的防腐上［28］，蓝莓叶由于高含量的多酚，有很强的抑菌活性。李春阳与冯进［29］测定了蓝莓叶多酚清除亚硝酸盐能力、DPPH、OH·能力；还原力、ORAC值(氧自由基清除能力)等，表明蓝莓叶多酚具有较强的抗氧化能力。Turhan等［30］研究发现蓝莓叶多酚含量高于蓝莓果中多酚含量，同时比蓝莓果具有有较强的还原能力和清除DPPH自由基能力。Skupie等［31］研究发现蓝莓叶提取物是对白血病HL60细胞最有效的，药效是草莓和覆盆子萃取物的2倍。Cignarella等［32］研究发现通过对链脲佐菌素糖尿病小鼠饲喂蓝莓叶提取物4d，血浆葡萄糖水平降低26%，血浆甘油三酯降低39%。同样Wang等［33］研究发现乌饭树叶片水提取物和醇提取物都具有降低糖尿病小鼠血糖的作用。Nagao等［34］研究表明蓝莓叶提取物降低血脂水平和C-反应蛋白，缓解肥胖大鼠肝脏甘油三酯积累。Sakaida等［35］研究表明蓝莓叶提取物强烈抑制血管紧张素转换酶的体外活性，抑制大鼠自发性高血压。王立等［36］研究发现乌饭树叶及其提取液对兔眼视网膜电流图有一定的影响，能明显改善并提高视网膜功能，对眼睛具有明显的保护作用。李颖畅等［37］研究表明蓝莓叶黄酮具有降低高血脂大鼠甘油三酯和胆固醇作用，同时提高超氧化物歧化酶和谷光甘肽过氧化物酶活性。Yuji等［38］研究发现蓝莓叶能降低胆固醇饮食大鼠的肝重，减少肝脏胆固醇的积累。
6·蓝莓叶多酚的开发利用
6.1用于食品防腐剂
化学防腐剂具有防腐效果好的优势，但它对人的身体健康有一定程度的不良影响，人们更希望开发出高效、广谱、安全稳定且价格便宜的新型天然防腐剂。食品的腐烂变质主要因素是酶和微生物的作用，植物多酚分子结构中由于含有大量的酚羟基，能够和蛋白质进行多位点结合，同时鳌合金属离子，破坏细胞亚结构，从而表现出强大的抑酶性和抑菌性。蓝莓叶多酚具有天然防腐特性，利用化学分析及其分离手段，从中提取天然的食品防腐剂，用于食品加工和贮藏过程中。
6.2用于食品着色剂
一般合成色素都有不同程度的毒性，有些甚至是致癌物质，因此，合成色素在食用方面越来越受到限制，目前有些国家已完全禁止在食品中加入任何合成色素添加剂。从唐代开始，人们就开始用蓝莓叶捣汁染制乌饭，现在很多地方仍有这种习俗。蓝莓叶中含有大量花色苷类多酚物质，花色苷具有保健功能，药用、食用价值也较高，同时也是天然食品着色剂。采用超临界流体萃取、微波辅助提取、酶法等现代高新技术提取。蓝莓叶多酚类色素对身体无害，具有很好的开发前景。
6.3用于营养保健食品
近年来，通过广泛而深入的研究，植物多酚已被称为第7营养素，蓝莓叶提取物中含有大量的植物多酚，研究表明蓝莓叶多酚具有抗氧化、降血糖、改善视力、增强免疫力等功效，决定了其具有很高的营养保健价值。从蓝莓叶中提取复合天然有效成分，利用现代制剂技术将其制成颗粒剂，并可以根据不同消费者口味习惯，添加不同的调味剂，食用时冲泡成溶液即可。
7·蓝莓叶多酚研究展望
蓝莓野生资源在我国分布范围广，目前栽培品种也在增多，但一直没有得到足够的重视和应用，对资源造成了很大的浪费。近年来，国内对蓝莓叶多酚的研究比较活跃，如何充分合理科学地利用我国丰富的蓝莓叶这一绿色资源已经成为一项重要课题。蓝莓叶中多酚含量丰富，多酚的提取技术已经成熟，研究与开发蓝莓叶多酚具有广阔的应用前景。为了更好的利用蓝莓叶多酚，应该从以下几方面进行改进或者深入研究：蓝莓叶多酚主要采用大孔树脂初步纯化，然后用硅胶柱色谱或者SephadexLH-20分离纯化，产品在颜色、纯度上不能满足国内外用户日益提高的要求，今后尽可能采用高效液相色谱、高速逆流色谱等先进的分离纯化技术提高产品纯度。同时膜分离法也是对酚类提取物进行分离纯化的技术之一，超滤是膜分离法中用途最广泛的方法，采用膜分离法对蓝莓叶多酚纯化，既不破坏多酚结构，也不污染环境，是值得探讨的蓝莓叶多酚纯化技术。蓝莓叶多酚具有抑菌作用，可用作食品防腐剂，加快蓝莓叶多酚保鲜剂的开发，蓝莓叶多酚的抑菌机理也需要进行深入研究。蓝莓叶多酚含有大量酚羟基，性质活泼，相对稳定性稍差，提高蓝莓叶多酚贮藏稳定性也是值得研究的课题。不同品种的蓝莓叶多酚组成和含量不同，它们的生物活性也存在差异，因此要加强蓝莓叶多酚构效关系的研究。(来源：中国食品添加剂应用网)