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酶催化法合成食品乳化剂的研究进展

    食品是多组分体系, 存在许多互不相容的相,混合不均匀会导致食品的品质缺陷, 如油水分离、焙烤食品发硬、巧克力糖起霜等。食品乳化剂能使互不相容的相形成均匀的分散体或乳化体, 从而提升食品质量, 改善食品组织结构、口感、外观, 改善食品的色、香、味, 改进加工工艺, 延长食品贮存期[1-2]。
    食品乳化剂已成为现代食品工业中不可缺少的添加剂, 种类多, 应用范围广, 用量约占食品添加剂总量的50%。目前允许用作食品添加剂的合成食品乳化剂主要有脂肪酸单甘油酯、脂肪酸糖酯、丙二醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、硬脂酰乳酸盐等几大类[3]。
    生产食品乳化剂的传统工艺是化学合成法, 往往存在反应过程条件激烈、不良反应多、产品难于分离纯化、产品色泽较深、污染大、能耗高等缺点, 对产品的精制提出较高的要求, 增加了精制成本。随着人们对产品质量要求的提高, 环保意识的加强, 需要开发清洁生产技术与方法。酶催化法具有如催化效率高、专一性强、反应条件温和、产品纯度高等优点, 符合清洁生产要求。随着生物技术和酶工程技术的快速发展, 酶的生产成本不断降低, 酶催化法合成食品乳化剂成为近年来的研究热点之一。
    1· 酶催化合成脂肪酸单甘酯
    脂肪酸单甘酯是广泛应用于食品、制药及化妆品工业的非离子乳化剂。全球食品乳化剂年产量约为20~ 25 吨, 其中脂肪酸单甘酯及其与二酯的混合物约占总产量的75%[4,5]。
    目前大规模生产脂肪酸单甘酯主要采用化学法,即在高温及无机碱催化下, 动植物油脂或脂肪酸与甘油反应制得。该法反应温度高、能耗大, 而且不良反应多、产率较低、产品质量差, 经分子蒸馏进行纯化, 后处理费用高[6-8]。酶催化法反应温度一般不超过80 ℃, 可有效地降低能耗, 减少副产物的产生,可提高脂肪酸单甘酯的收率和质量[9]。
    酶催化合成脂肪酸单甘酯主要有酯化法、甘油解法、水解法和酯交换法, 其中酯化和甘油解法最为常见。
    1.1 酯化法
    脂肪酶在有机溶剂中的高稳定性使其可催化水解反应的逆反应, 即脂肪酸与甘油的酯化反应, 生成脂肪酸甘油酯。
    对于酶催化酯化反应而言, 体系中的含水量对反应有着重要的影响, 反应初期必须要有少量的水以维持酶的高级结构, 发挥酶的催化活性。由于酯化反应是生成水的反应, 过量的水可能使生成的酯发生水解, 同时还将导致酶的结构改变而降低催化活性, 因此须严格控制体系的含水量[10]。研究[11-13]发现, 反应中存在一个含水量的临界值。为保证反应的顺利进行, 需采取相应的措施除去反应中生成的过量水, 如在体系中添加分子筛或者通过减压蒸馏除去水分[14-16]。还可以采用敞口反应的方法, 挥发除去部分水 [17,18]。
    酯化反应的底物甘油与脂肪酸的互溶性较差,属于非均相反应, 转化率较低。有效的方法是引入适当的溶剂以增大甘油与脂肪酸的接触, 以提高转化率。Monteiro 等[19]采用正己烷/叔丁醇混合溶剂体系,进行月桂酸与甘油的酶催化酯化反应, 8 h 内月桂酸转化生成月桂酸单甘酯的转化率为65%。此外, 采用高速搅拌、提高反应温度等方法也可以改善甘油与脂肪酸互溶性差的现象。
    1.2 水解法
    水解法是指油脂在脂肪酶的作用下, 发生水解生成甘油单酯和脂肪酸。水解法用酶多为1,3-特异性脂肪酶, 非特异性酶会继续将单甘酯水解为脂肪酸,而1,3-特异性脂肪酶只对甘油三酯的1,3 位酯键有识别作用, 从而保护了2 位酯键不被水解[20,21]。
    水解法的主要问题在于油脂水解制备脂肪酸单甘酯的同时会产生两倍的脂肪酸, 水解产物中存在大量的脂肪酸不仅会降低单甘酯的含量, 还会增加提纯的难度。另外, 在水溶液中油脂会发生酰基移位现象, 由2 位转移至1,3 位的酯键也会被脂肪酶识别、水解[22,23]。
    1.3 酯交换法
    酯交换法包括油脂的醇解反应和甘油与脂肪酸酯的酯交换反应。对于油脂的醇解反应, 由于体系中存在少量的水, 油脂在脂肪酶催化下也会发生水解,与酯交换反应存在竞争, 因此需严格控制体系的含水量。
    在荧光假单胞菌酶或猪胰脂酶的催化下, 用油脂或甘油三酯与醇进行酯交换反应制备脂肪酸单甘酯, 当含水量为3%, 酯交换反应速率是含水量为1%时的至少3 倍以上, 但当含水量超过5%时, 甘油酯水解开始与酯交换进行竞争, 产物中脂肪酸的含量增加[24]。
    洪哲等[25]在脂肪酶存在下, 以有机溶剂作为反应媒介进行甘油和脂肪酸甲酯的酯交换反应制备脂肪酸单甘酯, 可使甘油二酯的生成率控制在2%以下,同时以高于60%的转化率合成甘油单酯。
    1.4 甘油解法
    甘油解法是指油脂与甘油在脂肪酶催化下进行酯交换反应生成脂肪酸单甘酯。相对于上述三种方法来说, 甘油解法获得单甘酯的产率较高, 没有水或其他副产物产生, 符合原子经济性的要求, 因而备受关注。
    Noureddini 等[26]研究了脂肪酶催化大豆油甘油解的反应, 结果显示假单胞菌脂肪酶催化生成的脂肪酸单甘酯产率最高。Kaewthong 等[27]采用9 种脂肪酶催化棕榈油精进行甘油解反应, 固定化假单胞菌脂肪酶的催化活性最高, 并可将其用于填充床反应器和连续搅拌釜式反应器进行连续反应。
    甘油解反应也存在甘油与油脂的互溶性差的问题, 虽然无溶剂体系可以避免有机溶剂的不良反应,符合绿色化学的宗旨, 但由于体系黏度较大, 反应底物接触不充分, 因此需要选择合适的反应媒介, 以提高反应的转化率和单甘酯的收率。Damstrup 等[28]研究了13 种有机溶剂对甘油解反应制备单甘酯含量的影响, 研究结果表明, 叔丁醇和叔戊醇作为溶剂,反应速率较快, 单甘酯含量较高。叔丁醇与叔戊醇、或者其中之一与正己烷的混合溶剂体系也能获得较高的单甘酯含量(58% ~ 78%)。
    对于二元混合溶剂体系的研究[29]结果表明, 叔丁醇/叔戊醇(体积比80:20)最适合脂肪酶催化连续甘油解反应, 能在很短的反应时间内获得较高的单甘酯产率(47%~56 %), 同时溶剂成本较低, 且在蒸馏、浓缩等工艺过程中易于处理。以叔丁醇为溶剂, 脂肪酶催化茶花籽油甘油解反应制备脂肪酸单甘酯, 在甘油与油摩尔比6:1、底物浓度40%、温度50 ℃下反应10 h, 茶花籽油的转化率达98.7%, 脂肪酸单甘酯含量达82.0%[30]。
    研究[31-34]表明, 脂肪酶催化甘油解反应最常用的有机溶剂为叔丁醇、叔戊醇、正己烷以及它们的混合体系, 均能获得较为理想的效果。
    除了有机溶剂之外, 反胶束体系也是酶催化反应较为理想的介质。反胶束内部独特“水池”的存在使得其内部环境可能比水溶液更接近于天然细胞内环境, 酶比较容易溶入微小的水环境中, 能够保持稳定性和催化活性, 甚至能提高脂肪酶的催化活性[35, 36]。
    Chang 等 [37,38]研究了反胶束体系中脂肪酶催化三油酸甘油酯及橄榄油甘油解的反应, 选用表面活性剂琥珀酸二异辛酯磺酸钠(Aerosol OT, AOT)与异辛烷形成的反胶束体系。Oliveira 等[39–41]研究报道了反胶束体系中酶催化橄榄油甘油解的反应, 即表面活性剂与反应底物之一甘油形成反胶束, 在相对较低的酶浓度和反应时间内, 转化率高达70%。
    然而, 表面活性剂(如AOT 等)对脂肪酶的活性可能有一定的不利影响, 而且会增加产物分离和提纯的难度, 如果在产品中的残留会影响产品的质量。超临界CO2 作为环境友好型溶剂, 同时反应底物在超临界CO2 中的溶解度高, 用CO2 作为甘油解反应的溶剂可以提高反应速率, 提高单甘酯的产率。Jackson 等[42]将大豆油分别与甘油、1,2-丙二醇、乙二醇和甲醇在CO2 超临界体系中进行酯交换反应,单甘酯的产率可达87%, 而脂肪酸甲酯的产率将近100%。但是在超临界CO2 体系中, 反应要在高压下进行, 对设备要求高, 投资成本高, 在一定程度上限制了该方法的产业化应用。
    2 ·酶催化合成脂肪酸糖脂
    脂肪酸糖酯作为乳化剂广泛应用于食品、化妆品和医药等工业领域[42,43]。脂肪酸糖酯的合成方法主要有两种: 化学法和酶法。化学法往往是在高温、有毒溶剂及碱性催化剂下进行的[44-48], 这就使得产品色泽较深、有异味。因此脂肪酶催化法合成脂肪酸糖酯引起了广泛关注[49-52]。
    目前酶催化法合成脂肪酸糖酯主要有酯化反应和酯交换反应。Soultani 等[53]用C8-C18 的脂肪酸与果糖在固定化南极假丝酵母脂肪酶催化下合成果糖酯。Sakaki 等[54]研究了棕榈酸与果糖和葡萄糖在叔戊醇中进行酶催化酯化反应, 其中果糖棕榈酸单酯和二酯的总收率达66%。以麦芽糖和肉豆蔻酸为原料, 以叔丁醇作为反应介质, 脂肪酶催化进行酯化反应, 转化率可达到91.4%[55]。
    以脂肪酸的小分子酯类为反应底物, 与糖进行酶催化酯交换反应也可生成脂肪酸糖酯。Ferrer 等[56]以蔗糖、麦芽糖和葡萄糖为原料, 在叔戊醇/二甲基亚砜混合溶剂中, 分别与月桂酸乙烯酯进行脂肪酶催化酯交换反应制备脂肪酸糖酯, Novozym 435 脂肪酶作催化剂易于获得6,6’-二月桂酸糖酯, 而米曲霉脂肪酶选择性地催化合成6-O-月桂酸糖酯。李军生等[57]在叔戊醇/二甲基亚砜混合溶剂中, 脂肪酶催化蔗糖和月桂酸乙烯酯进行酯交换反应制备蔗糖-6-月桂酸单酯, 转化率达97.2%。
    脂肪酶催化脂肪酸糖酯的合成工艺尚存在一些难题。首先, 虽然酶催化反应的选择性很高, 但是在脂肪酸糖酯的酶法合成中, 一般是伯羟基优先酯化生成单酯, 但当单酯浓度达到一定程度时, 脂肪酶还会以单酯为底物继续催化酯化, 形成双酯、三酯。其次, 糖作为主要的反应底物, 具有较强的极性, 能很好的溶于DMF、DMSO、吡啶等极性溶剂中, 但是这些溶剂容易使酶变性失活, 同时都有一定的毒性, 限制了产品在食品、医药及化妆品领域的应用。新型环境友好的反应媒介, 如离子液体[58,59]、超临界CO2 等[60]可替代有机溶剂用于脂肪酶催化脂肪酸糖酯的合成, 但是合成工艺有待深入研究。
    3· 酶催化合成丙二醇脂肪酸酯
    1,2-丙二醇脂肪酸酯(丙二醇酯)作为食品乳化剂,其用量仅次于脂肪酸单甘酯、大豆磷脂等品种, 具有广阔的发展前景。目前, 大规模生产丙二醇酯主要采用化学法合成, 需要在无机催化剂、高温高压条件下进行, 能耗高, 反应产物成分复杂, 有颜色深的副产物产生, 有异味和毒性, 产品纯度不高, 需要经过分子蒸馏获得高纯度的丙二醇酯[61]。
    酶催化合成丙二醇酯也主要通过脂肪酸与1,2-丙二醇的直接酯化和油脂与1,2-丙二醇的酯交换反应。脂肪酸作为原料, 生产成本高, 且酯化法合成的丙二醇脂肪酸酯转化率不高, 产品纯度不高。而酯交换法的原料一般为天然动植物油脂, 成本低、容易获得。Shaw 等[62]研究了脂肪酶催化丙二醇与不同的酰基供体(脂肪酸、脂肪酸乙酯、脂肪酸酐和脂肪酸甘油三酯)反应合成丙二醇单酯, 研究结果显示, 脂肪酸酸酐作为反应底物生成的丙二醇酯产率最高, 其次是脂肪酸甘油三酯, 效果最差的是脂肪酸。
    反应媒介的选择也是酶催化合成丙二醇酯的关键, 以叔丁醇作为溶剂, 脂肪酶催化脂肪酸三甘酯与丙二醇的酯交换反应制备丙二醇酯乳化剂, 其中棕榈酸丙二醇单酯的含量可达74.6%[63]。Chen 等[64]研究了溶剂对脂肪酶催化合成丙二醇酯的影响, 在叔戊醇中可获得75%的单酯, 而在正己烷/正辛烷(1:1)混合溶剂中可获得55%的丙二醇双酯。Chevandier 等[65]的研究表明1,3-特异性脂肪酶催化油酸与1,2-丙二醇和1,3-丙二醇合成丙二醇单酯, 油酸与1,2-丙二醇反应的转化率为74%, 丙二醇单酯的含量100%; 而油酸与1,3-丙二醇反应的转化率为98%, 丙二醇单酯的含量35-90%。Shaw 等[66]研究了在正己烷/叔丁醇(9:1)混合溶剂中, 脂肪酶催化丙二醇和月桂酸直接酯化合成月桂酸丙二醇单酯, 转化率为96%。还有以1,4-二氧六环作为溶剂, 在微波辅助下酶催化合成丙二醇酯[67]。
    李伟[68]以正己烷为溶剂, 月桂酸与1,2-丙二醇在脂肪酶催化下, 月桂酸酯化率达90.1%, 单酯纯度为81.4%, 而在无溶剂体系中, 月桂酸酯化率达到90.3%, 单酯纯度为78.2%。酯交换反应同样也可以在无溶剂体系中进行, 以椰子油和丙二醇为原料, 脂肪酶催化合成椰油基丙二醇单酯, 含量可达53.2%[69]。
    4· 酶催化合成失水山梨醇脂肪酸酯
    失水山梨醇脂肪酸酯的合成通常是由山梨醇与脂肪酸进行酯化而得, 目前大规模生产工艺采用化学法[70,71], 即以酸或碱作为催化剂, 在高温条件下脱水酯化, 产物复杂, 单酯含量不高, 而且产品色泽较深。
    为获得优质的失水山梨醇脂肪酸酯, 脂肪酶催化法引起了科学家们的关注。以山梨醇为原料, 先脱水生成失水山梨醇, 再以低沸点共沸物叔丁醇/正己烷混合体系作为反应媒介, 脂肪酶催化酯化制备失水山梨醇脂肪酸酯 [72]。Arcos 等[73]研究了以丙酮作溶剂, 辛酸、月桂酸与山梨醇的酶催化酯化反应, 底物山梨醇的转化率100%, 1,6-二酯的产率达95%以上。王栋等[74-76]研究了无溶剂体系中脂肪酶催化合成失水山梨醇油酸酯, 转化率高, 产物中单酯含量可达80%, 而化学法合成的产物中单酯含量约50%。
    5· 总结和展望
    由于应用领域特殊, 要求食品乳化剂除了具备表面活性之外还需具备可食用性, 即安全性必须放在首位。酶催化合成法具有安全、环保、节能、高效、专一性强的优势, 因而引起了研究人员们的极大兴趣。最广泛应用的几大类食品乳化剂大部分属于脂肪酸酯类, 因此采用脂肪酶催化酯化或酯交换反应确实是一个行之有效的方法。但是目前食品乳化剂的酶催化合成大部分处于实验室或中试研究阶段, 为实现大规模生产还有很多问题尚待深入研究, 如脂肪酶催化反应机制的研究, 底物选择性的控制, 绿色无毒反应媒介的选择, 酶催化反应器的设计, 目标产物转化率有待进一步提高等。随着科学技术的发展和科学研究的不断深入, 酶催化法合成食品乳化剂将会得到更广泛的应用。

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