当前位置：首页>行业聚焦

蛋源性抗氧化肽研究进展

    人体的正常生理代谢会产生一些活性氧（ROS），如HO·、HO2·、O2-·、H2O2、O2·[1]，其中，HO·、O2-·、H2O2在人体中的含量最多[2]。研究表明ROS能够对DNA、蛋白质等生物大分子物质产生氧化性损伤[3]，据报道，这些物质在一些疾病（癌症、冠心病、糖尿病、风湿性关节炎、老年痴呆）的发生过程中起着重要作用[4]。在食品加工中，脂肪氧化是人们关注的主要问题之一，因为它可以导致食品产生一些哈喇味，同时还潜在一些有毒性的反应产物[5]。目前，虽然市场上有一些人工合成的抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、二叔丁基对甲酚（BHT）、叔丁基对二苯酚（TBHQ）等用于食品加工中，但这些合成抗氧化剂的不规范使用或滥用对于人体健康具有潜在的危害[6-7]，因此，迫切需要开发一些天然安全的抗氧化剂。
    从食物蛋白中获得的生物活性肽，大多由3~20个氨基酸残基组成，其活性与氨基酸组成和氨基酸序列有关[8-9]，这些多肽除其自身具有营养和功能特性，还具有活性强、分子质量小、易吸收等特点，并且它们比合成的抗氧化剂更安全、更健康[10]。从食物蛋白中获得抗氧化肽成为近些年的研究热点之一，人们已分别从大豆[11]、乳清[12]、鱼[13]等动植物蛋白中酶解制备出抗氧化活性肽。而富含蛋白质的禽蛋自然成为分离或制备天然抗氧化肽的研究对象之一，禽蛋蛋白质经过酶解后，可以得到一些抗氧化活性肽，可将其作为抗氧化剂用于食品加工、化妆品、功能性食品以及药物的开发应用中。文章综述了蛋源性抗氧化肽的来源、活性构效关系、应用以及存在的问题，可为蛋源性抗氧化肽的开发提供理论支持。
    1· 禽蛋蛋白质组成
    禽蛋蛋白质含量丰富且易被消化吸收，其氨基酸组成与人类必需氨基酸比例接近[14]。蛋清中蛋白质的含量为11%~13%，主要有卵白蛋白、卵球蛋白、卵黏蛋白、类黏蛋白和伴白蛋白等；蛋黄中的蛋白质多为磷蛋白和脂肪结合而成的脂质蛋白质，包括低密度脂蛋白（65%）、卵黄球蛋白（10%）、卵黄高磷蛋白（4%）、高密度脂蛋白（16%）、其他（5%）[15]。大量研究表明，禽蛋类蛋白和多肽不仅可为人类提供基本的营养需求，而且还具有多种生物效应，如抗菌活性、免疫调节作用、抗癌和抗高血压活性，这些生物活性表明禽蛋蛋白在人类健康、疾病的预防中有重要作用[16]。这为蛋源性抗氧化肽的制备提供了丰富的物质基础。
    2· 蛋源性抗氧化肽
    近年来，人们通过酶解禽蛋已获得多种抗氧化肽，主要来源于全卵清、卵白蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶和蛋黄蛋白质。这些抗氧化肽具有活性强、分子质量小、易吸收等特点。其中有多个抗氧化肽已确定氨基酸序列，具体见表1。
    
    2.1 全卵清源抗氧化肽
    卵清，即蛋清、蛋白，约占整个蛋质量的60%左右，水和蛋白质是其主要成分，在蛋清蛋白中含量最多的是卵白蛋白，其次是卵转铁蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶。卵清源抗氧化肽有以全蛋清为原料制备的，也有来源于蛋清中纯卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的抗氧化肽。
    Hamid等[17]利用胃蛋白酶酶解鸵鸟蛋蛋清获得了LTEQESGVPVMK，该多肽具有较强的抗氧化活性，20μg/mL时，亚油酸自氧化抑制率为86.4%，200μg/mL时，DPPH的清除率达到81%，90.9μg/mL时，ABTS清除率为37.6%。Hamid认为其抗氧化活性可能是由其N-末端的Leu和C-末端的Lys起主要作用，有研究[23]认为C-或N-末端的疏水性Leu能够促进多肽与脂肪酸之间的相互作用，进而起到抗氧化作用。
    Chen等[18]用不同的酶酶解鸡蛋蛋清，发现水解产物的抗氧化性受水解时间和酶的类型影响，其中用木瓜蛋白酶酶解3h得到的水解产物的DPPH自由基的清除能力最强。通过RP-HPLC对水解物分离纯化，经LC-MS/MS测序得到两个多肽，分别为Tyr-Leu-Gly-Ala-Lys（551.54u）和Gly-Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe-Gln（974.55u），通过化学合成这2个多肽，发现二者对DPPH自由基的清除能力分别为粗蛋清水解液的7.48倍和6.02倍，这些结果提示由木瓜蛋白酶酶解鸡蛋清得到的水解液或多肽或许可用于食品加工和功能食品的开发。
    Chen等[24]分别用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味酶酶解鸭蛋蛋清，发现由木瓜蛋白酶酶解的鸭蛋清获得的多肽含量最高，并且其含量随着酶与底物浓度比例（E/S）的增加而增加，这表明鸭蛋清的水解度随着木瓜蛋白酶的增加而提高，通过Tricine-SDS-PAGE也证明了这一点，此外，通过SDS-PAGE还证实了，木瓜蛋白酶是所用的这几种酶中唯一能够使鸭蛋清蛋白水解的酶。对木瓜蛋白酶酶解的鸭蛋清多肽进行抗氧化活性分析，发现其对亚油酸氧化体系和超氧阴离子的抑制能力高于70%，对Fe2+的螯合能力高于90%。由此可见，木瓜蛋白酶酶解鸭蛋蛋清获得的肽有较强的抗氧化能力，这可能与蛋白酶具有较强的水解专一性有关。
    Lin等[25]用碱性蛋白酶酶解蛋清蛋白粉，探讨样品分子质量对还原能力的影响以及经高强度脉冲电场处理后的样品的还原能力。结果发现其碱性蛋白酶水解液具有较强的还原能力，特别是经1ku超滤膜截留后的样品，其还原能力更强，用高强度脉冲电场对分子质量小于1ku的样品进行处理6h，发现该样品的还原能力呈先升高后下降的趋势，处理4h时，其样品的还原能力最强。用高效液相色谱分析经高强度脉冲电场处理4h后的水解样品，明确证实了高强度脉冲导致部分大分子质量的多肽降解成了小分子肽，Perez等[26]认为高强度脉冲可能会导致多肽分子两极分化，破坏分子间的非共价键如疏水作用、静电作用、氢键，分离出更多的亚基，导致蛋白质结构紊乱，这可能是促使小分子肽表现出更好的生物活性的原因[27]。
    Manso等[28]给患有自发性高血压的小鼠按每天0.5g/kg的剂量长期喂食由胃蛋白酶酶解的鸡蛋清水解物，通过研究小鼠的抗氧化能力和血脂发现，患有自发性高血压的小鼠的血浆的抗氧化能力逐渐增强，主动脉中的丙二酮的浓度逐渐减少。这一结果表明鸡蛋清的胃蛋白酶水解物在患有自发性高血压的小鼠的抗氧化防御系统中起着重要作用，同时在不改变高密度脂蛋白水平的情况下，对降低甘油三酯和胆固醇具有有益效果。Manso认为鸡蛋清的胃蛋白酶水解物可能有利于改善由代谢紊乱引起的一些疾病如高血压、氧化应激、高血脂等。
    用酶酶解全卵清，其抗氧化活性增强，这意味着全卵清中具有抗氧化多肽，然而，采用不同的酶作用，得到的酶解产物对于不同的抗氧化指标表现出的抗氧化活性不同，这可能与酶具有较强的专一性有关。不同的酶具有不同的酶切位点，其酶解产物表现出的抗氧化活性不同，因此，在酶解制备抗氧化肽时，酶的筛选以及抗氧化指标的选择对后续制备高活性的抗氧化肽至关重要。
    2.2 卵白蛋白源抗氧化肽
    DAVALOS等[19]用胃蛋白酶酶解蛋清获得4个抗氧化肽Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu，Ser-Ala-Leu-Ala-Met，Tyr-Gln-Ile-Gly-Leu，Tyr-Arg-Gly-Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe，这4个抗氧化肽序列均包含于卵白蛋白序列中。分析这4个多肽的抗氧化活性，其氧自由基荧光吸收值（ORAC-FL）分别为3.809、2.659、1.718、1.184μmol TE/mg多肽，其中Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu的ORAC-FL值是α-生育酚（0.64μmol TE/mg多肽）的6倍多，因此，可以认为该多肽是一种强抗氧化剂。
    徐明生[20]用胃蛋白酶酶解鸡卵白蛋白，获得3个抗氧化活性多肽Pro-Glu-Tyr（分子质量408.14u）、Leu-Pro-Asp-Glu（分子质量473.19u）、Trp-Val-Glu（分子质量433.18u）。考察了酶解提取物的超氧阴离子、羟基自由基的清除能力，以及亚麻酸氧化体系，水解产物浓度达到5mg/mL时，超氧阴离子和羟基自由基的清除率分别为45%和56%，对亚油酸的抑制率等同于0.2mg/mL VE的抑制率。通过经D-半乳糖复制衰老小鼠模型的体内抗氧化实验发现，给衰老小鼠喂食高、中剂量的水解提取物后，能够极显著（p＜0.01）的抑制小鼠血清和肝脏中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、氢化酶（CAT）的下降，同时能够极显著（p＜0.01）降低衰老小鼠血清和肝脏中的丙二醛（MDA）含量，这说明由卵白蛋白酶解制备的抗氧化肽能够有效起到抗氧化的作用。
    2.3 卵转铁蛋白源抗氧化肽
    Huang等[29]将鸡蛋卵转铁蛋白经超声波处理120s，80℃加热处理10min后，用嗜热菌蛋白酶在pH8.0 60℃下酶解3h，接着再用胃蛋白酶在pH2.0 37℃下酶解3h，水解产物离心后得到上清液即为卵转铁蛋白水解物。Huang考察了卵转铁蛋白、卵转铁蛋白水解物以及从卵转铁蛋白中提取的ACE抑制肽IRW和LKP的抗氧化活性。结果表明，水解物的抗氧化能力显著高于卵转铁蛋白，IRW具有较强的氧自由基清除效果，通过化学合成IR、RW、I、R、W发现IR和W具有较高的抗氧化能力，这可能与IRW表现出的强抗氧化能力有着一定联系。
     2.4 溶菌酶源抗氧化肽Memarpoor-Yazdi等[21]用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶以及二者组合酶解鸡蛋清中的溶菌酶，分析水解液的DPPH、ABTS自由基清除能力、Fe2+螯合能力以及脂质过氧化抑制率，发现用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶联合酶解溶菌酶得到的水解液的抗氧化能力要高于用单一酶酶解得到的产物。将混合酶水解液经反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离后，将活性最强的F2组分经串联质谱分析测得其序列为NTDGSTDYGILQINSR，分子质量（1753.98±0.5）u，来自溶菌酶的第46~61位残基。该片段具有较强的抗氧化活性，其对DPPH自由基清除率的EC50值为1.21mg/mL，Fe2+螯合能力的EC50值为1.35mg/mL，该活性可能与其序列中含有1个Arg和2个Asp残基有关。这表明溶菌酶水解液或者分离出的多肽也许可以用于食品添加剂以及日常的饮食中。
    You等[30]用碱性蛋白酶酶解鸡蛋清中的溶菌酶，水解液通过阳离子交换柱色谱和分子排阻色谱分离后，分析水解液和各分离组分的抗氧化活性发现，分离得到的这些组分，主要来自溶菌酶序列的第13~23、42~57和90~108位。水解液的ORAC-FL值为0.463μmol TE/mg蛋白，而分离组分的ORAC-FL值为0.387~2.774μmol TE/mg蛋白；经ABTS实验，其水解液的总抗氧化能力（TEAC）值为1.698μmol TE/mg蛋白，而各分离组分的TEAC值为1.401~3.777μmol TE/mg蛋白，这一结果表明溶菌酶水解液和其分离片段或许可以用于功能保健食品的开发。
    Rao等[31]模仿胃肠道消化系统，采用α-糜蛋白酶和胰蛋白酶酶解鸡蛋清中的溶菌酶，得到水解产物LPH2，再将其经3ku的超滤膜截留得到LPH2~3ku。当浓度为2mg/mL时，LPH2和LPH2~3ku的DPPH自由基清除率分别为25.7%和65.3%；分析LPH2~3ku的还原能力，当浓度为2mg/mL时，其在700nm下的吸光值为0.29。通过超高效液相色谱-基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（UPLC-MALDI-TOF-TOF MS）联用技术对LPH2~3ku分析，获得38个多肽序列，这些肽在其序列中含有Phe、Tyr和Trp或在C-末端含有Leu残基，这些残基可能是使其表现出抗氧化活性的原因[32]。
    2.5 蛋黄源抗氧化肽
    在食品加工中，蛋黄作为功能和营养成分被广泛应用，蛋黄中的主要成分为三酰基甘油、卵磷脂、蛋白质和碳水化合物，研究已证实蛋黄[33]、蛋黄卵磷脂[34]以及卵黄高磷蛋白[35]均具有抗氧化活性。
    Park等[22]采用碱性蛋白酶，在pH7.0 50℃下将脱卵磷脂的蛋黄酶解18h，将水解物经超滤截留分离后，再通过连续的色谱分离，最终获得了2个抗氧化多肽，其序列分别为Leu-Met-Ser-Tyr-Met-Trp-Ser-Thr-Ser-Met和Leu-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Arg-Ser-Ser-His-Trp-Phe-Ser-Arg-Arg，其中后者具有较强的抗氧化活性，在抑制亚油酸氧化体系中它的抑制能力比α-生育酚高61%。研究证实[35]，蛋黄中的卵黄高磷蛋白具有较强的抗氧化活性，能够有效的螯合铁离子，这与其高度的磷脂化形式有关。Aleksandra等[36]发现蛋黄蛋白质经脱磷化作用后不具有抗氧化活性，Aleksandra用胃蛋白酶、糜蛋白酶以及胰蛋白酶分别酶解去磷脂化的蛋黄蛋白质并分析水解液的抗氧化活性，酶解4h后，胰蛋白酶水解液的DPPH自由基清除能力最强，相当于0.85μmol TE/mg，胃蛋白酶和糜蛋白酶的DPPH自由基的清除能力要弱一些，分别为0.3、0.7μmol TE/mg；在水解过程中糜蛋白酶水解液和胰蛋白酶水解液的Fe3+还原能力呈现升降升的趋势，而胃蛋白酶水解液的Fe3+还原能力变化趋势与之相反。酶解4h后，糜蛋白酶水解液的Fe3+还原能力达到最大7.5μg Fe2+/mg，而胃蛋白酶的还原能力在酶解0.5h后达到最大3.8μg Fe2+/mg。蛋白酶水解液的Fe3+还原能力呈现出或升或降的趋势，这些变化可能与不同的酶在酶解过程中暴露的电子和氨基酸侧链基团的致密度有关[36]。
    Xu等[37]用胰蛋白酶酶解经部分脱磷酸作用的卵黄高磷蛋白，并比较了水解液与卵黄高磷蛋白的抗氧化活性，结果表明，与卵黄高磷脂蛋白相比，经脱磷酸作用后的卵黄高磷脂蛋白水解液（PPPs）具有较强的抑制脂质过氧化活性和DPPH自由基清除能力，但其对Fe2+的螯合能力要弱于卵黄高磷脂蛋白。Xu研究证实PPPs表现出的强抗氧化活性主要取决于其氨基酸组成而不是磷脂酰丝氨酸配体的含量，很可能是His、Met、Tyr这些氨基酸残基在PPPs的强抗氧化活性中起着重要作用。Sakanaka等[33]用芽孢杆菌生产的食用级蛋白酶酶解脱脂的鸡蛋黄，研究其水解液在亚油酸氧化体系中的抗氧化活性，发现脱脂蛋黄水解液对抑制亚油酸的氧化要显著强于蛋黄。将脱脂蛋黄蛋白质酶解液加入含有亚油酸的饼干中，与对照组相比，脱脂蛋黄水解液表现出较强的抗氧化活性，它能有效抑制含有亚油酸饼干的氧化值（POV）的增长。这表明脱脂蛋黄蛋白质酶解液是一种天然的抗氧化剂，能够有效抑制多不饱和脂肪酸的氧化。此外，Sakanaka等[38]还研究表明，当脱脂蛋黄蛋白质酶解产物的浓度为0.5%时，其对DPPH自由基和羟基自由的清除率分别为74.2%和91.7%，将该蛋黄蛋白质水解液加入碎牛肉和金枪鱼鱼糜中，发现其能有效抑制硫代巴比妥酸（TBARS）的反应产物，这一结果表明蛋黄蛋白质水解物是制备天然抗氧化剂的一个很好的来源。
    3· 蛋源性抗氧化肽的活性构效关系
    大量研究发现，蛋白水解多肽的抗氧化生物活性主要与其结构、氨基酸序列组成、氨基酸特性或在溶液中的分散性有关[39]，这些因素又受蛋白质来源和水解条件如消化酶、温度、水解时间以及酶和底物的比例等的影响[10]。
    一些特殊氨基酸残基在抗氧化肽的活性中起着主要作用，如Tyr、His、Leu等[40]。DAVALOS等[19]用胃蛋白酶酶解蛋清获得4个抗氧化肽，研究发现Tyr-Ala-Glu -Glu -Arg -Tyr -Pro -Ile -Leu、Tyr -Gln -Ile -Gly -Leu、Tyr-Arg-Gly-Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe这3个多肽的抗氧活性可能主要由N-末端的Tyr残基决定，因为在测定的所有氨基酸单体中，Tyr的ORACFL值最高。Moosmann[41]也得出了这一结论，当去掉Tyr残基后，一些分泌肽激素就失去了其抗氧化活性。这可能是由于活性肽肽链中Tyr残基的酚环和吲哚结构充当氢供体，当给予自由基后，自身生成稳定的自由基中间体，因而这类多肽具有强抗氧化性[42]。
    为了证实Tyr在Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu强抗氧化活性中的作用，DAVALOS合成了Tyr-Pro-Ile-Leu和Tyr-Pro-Ile 2个短片段，分析二者抗氧化活性发现，ORAC-FL值均低于Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu，但Tyr-Pro-Ile的ORAC-FL值高于Tyr-Pro-Ile-Leu，而Leu单体不具有抗氧化活性。DAVALOS认为这能够表明Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu中的第二个Tyr具有重要作用。
    此外，Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu序列中含有2个酸性氨基酸，Suetsuna等[43]认为酸性氨基酸具有金属离子螯合作用，这或有助于其表现出强抗氧化活性。Park等[22]用碱性蛋白酶酶解脱卵磷脂的蛋黄得Leu-Met-Ser-Tyr-Met-Trp-Ser-Thr-Ser-Met、Leu-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Arg-Ser-Ser-His-Trp-Phe-Ser-Arg-Arg，其抗氧化活性与N-末端的Leu残基以及序列中的His残基有一定的关系。已证实N-末端的Leu残基具有抗氧化作用[44]，此外，抗氧化活性较强的Leu -Glu -Leu -His -Lys -Leu -Arg -Ser -Ser -His-Trp-Phe-Ser-Arg-Arg中还含有His残基，有研究[45-46]表明，含His残基的多肽具有抗氧化活性，这可能与His残基上的咪唑环的螯合作用以及对脂质原子团的捕获能力有关，但含有His残基的多肽的抗氧化活性要比His残基自身的抗氧化活性要高，这可能与多肽的疏水性增加有一定的关系。
    Mendis等[47]研究证实，多肽序列中的一些疏水性残基如Leu、Val、Pro、Met与其强抗氧化活性有一定关系，因为这些疏水性氨基酸能够增强其在脂肪中的溶解度以及和自由基相互作用。DAVALOS等[19]用胃蛋白酶酶解蛋清获得Ser-Ala-Leu-Ala-Met，他认为Met残基是Ser-Ala-Leu-Ala-Met表现出抗氧化活性的原因之一，Met是一个含硫氨基酸，易被氧化成Met硫化物[48]，Met可以作为在生理pH条件下易受氧化剂影响的蛋白质的内源性抗氧化剂[49]。Hamid等[17]用胃蛋白酶酶解鸵鸟蛋蛋清获得LTEQESGVPVMK，分析其抗氧化活性发现，其对亚油酸自氧化的抑制率和DPPH自由基的清除率分别能达到77.3%和81%，而对ABTS的清除率仅为37.6%，这表明该肽与脂溶性的DPPH自由基之间的反应较容易，而不易与水溶性的ABTS自由基反应，Hamid认为这可能与LTEQESGVPVMK中的疏水性氨基酸Leu、Val、Pro、Met有一定的关系；LTEQESGVPVMK中还含有丰富的Glu、Val、Gln，Baumy等[50]证实，这些残基能够有效清除自由基，此外，Glu是一个有效阳离子螯合剂，它能够与Ca、Fe、Zn 形成复合物，这可能也是使LTEQESGVPVMK表现出强抗氧化活性的原因之一。
    4· 蛋源性抗氧化肽存在问题与展望
    目前从动物蛋白中制备抗氧化肽主要采用微生物发酵或蛋白酶酶解的方法。其中蛋白酶酶解方法被广泛应用，该方法能够有效提高蛋白质的功能特性。如酶解脱脂的蛋黄后其抗氧化活性得到显著的提高[33]，这可能是由于酶解过程中可促使更多的活性氨基酸侧链暴露出来[51]；此外，酶解过程可能会将折叠的蛋白质侧链展开，使蛋白质内部的疏水性基团暴露出来，增强其疏水性，近而促使其表现出更强的抗氧化活性。虽然酶解方法制备蛋源性抗氧化肽有一定的优势，但要实现工业化生产及应用还有一些问题有待解决：a.禽蛋蛋白质含量丰富，经酶解后其产物复杂，造成目标物的分离纯化过程费时、费力且效率较低，不利于工业化生产。因而，寻找一种能够快速、高效地纯化蛋源性抗氧化肽的方法，对以后开发新型蛋源性抗氧化肽有一定意义。b.目前，蛋源性抗氧化肽的活性构效关系仅有一些可能的活性序列和活性位点以及肽链内氨基酸与活性关系的推测性研究，还没有统一完整的理论模型，因而进一步研究抗氧化肽活性构效关系，揭示其抗氧化机理对于人工合成和开发新型抗氧化肽有重要的理论意义。c.虽然蛋源性抗氧化肽来自于人们长期食用的禽蛋制品，但在开发成商业产品前需进行严格的安全性评价，目前这方面的研究较少，因而，对蛋源性抗氧化肽进行一些毒理学实验以及临床实验具有实际意义。
    禽蛋蛋白质营养丰富，且易吸收，是制备抗氧化肽的一个良好来源。从禽蛋蛋白质中酶解获得的小分子抗氧化肽类物质，具有活性强、分子质量小、易吸收等特点，同时将抗氧化肽类制品作为天然抗氧化剂广泛应用于食品加工、化妆品、功能性食品以及药物的开发应用中，对提高禽蛋的深加工、增加附加值也将会有重要的意义。

附件：            

用户名：
密　码：
验证码：