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苯甲酸酯抗菌性能的研究

   苯甲酸又名安息香酸，纯品为白色有丝光的鳞片或针状结晶，质轻无味或微有安息香或苯甲醛气味。苯甲酸是世界各国普遍允许使用的一种食品保鲜剂，它在动物体内易随尿液排出体外，不蓄积，毒性低且价格低廉，目前占据了国内大部分的保鲜剂[1]市场。但由于苯甲酸是一种有机酸型食品保鲜剂，只有在其分子态中才能有效抑制微生物的生长[2]，所以苯甲酸只适宜在偏酸性(pH<4.5)的条件下适用，pH3时抗菌效果最好，使用范围受到很大的限制。为了打破环境条件对苯甲酸抑菌活性的制约，学者通过对苯甲酸分子进行酯化修饰来提高其抑菌的pH值范围和抗微生物代谢性，从而改善其抑菌性能。本文采用直接酯化法，合成苯甲酸乙酯、丙酯、丁酯等一系列酯，研究这几种酯对牛乳混合菌的抑制作用。
    1· 材料与方法
    1.1 仪器和药品   不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；722s可见分光光度计：上海奥普勒仪器有限公司；ZD-85A气浴恒温振荡器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DHG-9077A电热恒温鼓风干燥箱：上海申光仪器仪表有限公司。
    牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、苯甲酸、苯甲酸钠、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇：分析纯；鲜牛乳：市售。
    1.2 实验用菌
    牛乳酸败混合菌[3]。
    1.3 实验用的培养基
    牛肉膏蛋白胨培养液，其组成为：蛋白胨1%，牛肉浸膏0.5%，氯化钠0.5%，葡萄糖1%，pH：7.2~7.5，120 ℃灭菌20 min。
    1.4 酯化反应
    将苯甲酸与相应的醇按一定的摩尔(mol)置于具回流装置的三口烧瓶中，缓缓加热。待苯甲酸完全溶解后，加入相应的醇、催化剂，缓慢升温加热回流4 h。反应结束后用饱和食盐水、5%碳酸钠溶液洗涤，用无水硫酸镁进行干燥，经蒸馏收集相应的馏分，得到具有香脂香气无色油状液体——苯甲酸酯。
    1.5 抗菌实验
    1.5.1 最低抑菌浓度的测定
    将苯甲酸和苯甲酸酯配制成不同的浓度加入到装有10 mL肉汤培养基的试管中，然后加入牛乳酸败混合菌0.1 mL，充分混匀，另做2个对照管(空白和含菌)。于37 ℃的生化培养箱中培养24 h，用目测法比较各试管的浑浊程度，从而找出各防腐剂的最低抑菌浓度。
    1.5.2 抑菌活性测定
    采用分光光度法测定合成产物对牛乳酸败混合菌生长的抑制能力。将一定量的牛乳酸败混合菌加入培养基中，装至250 mL三角瓶中，每瓶装入150 mL，并加入最低抑菌浓度的防腐剂量，用经过消毒杀菌的棉布封住瓶口，置于混合菌最适合生长温度(37 ℃)下培养，每隔6h测定A560 mm，计算防腐剂的抑菌率IR[4]。
   
    2· 结果与讨论
    2.1 产物性质
    常温下，产物为无色或淡黄色透明液体，有特殊的香味，各产物的折光率nd分别为：苯甲酸乙酯1.5007，苯甲酸丙酯1.4972，苯甲酸丁酯1.4940。
    2.2 防腐剂的最低抑菌浓度
    于37 ℃气浴恒温振荡器中培养24 h后取出试管，肉眼观察其浑浊程度，记录最小抑菌浓度。各食品防腐剂的最低抑菌浓度如表1所示。
   
    2.3 pH对防腐剂抑菌效果的影响
    固定培养液的温度37 ℃，在各食品防腐剂的最低抑菌浓度下，通过在pH4~8时对食品防腐剂的抑菌性进行了研究，吸光度随时间变化曲线结果如下图1~图4所示。
   
   
    由图1至图6可以看出，pH4~6的条件下，在添加防腐剂的最低抑制浓度下，苯甲酸、苯甲酸钠以及苯钾酸酯都有很好的抑菌效果；在pH7～9时，苯甲酸和苯甲酸钠几乎没有抑菌性；而苯甲酸酯依然表现很好的抑菌效果，尤其是苯甲酸乙酯和苯甲酸丙酯在接种后72 h中混合菌的生长均被抑制在很低的水平，而随着苯甲酸酯中R烷基碳链的增长，亲油性越强，因而苯甲酸丁酯的水溶性要低于苯甲酸乙酯和丙酯，在最低抑菌浓度下实际起防腐作用的防腐剂量也小，使得其抗菌强度低于苯甲酸乙酯和丙酯。
    苯甲酸和苯甲酸钠酸性环境下以分子态存在，更易透过微生物细胞膜进入细胞体内，起到抑菌作用；而pH较高时，多数以离解的状态存在，不易通过微生物细胞膜起作用，所以苯甲酸和苯甲酸钠适宜在酸性食品中使用。在pH4~9范围内，苯甲酸乙酯和苯甲酸丙酯均以分子态存在于介质中，因而其防腐效果受pH的影响不大，可在较广的酸碱度范围内使用。
    2.4 防腐剂抑菌率的比较
    分别计算在37 ℃，pH7.2苯甲酸、苯甲酸钠和苯钾酸酯类对混合菌群的抑菌率，作出苯甲酸、苯钾酸酯和苯甲酸酯类对混合菌群的抑菌率随培养时间变化的曲线，绘成图7。
   
    在6 h前，添加的防腐剂由于没有完全发挥作用，微生物生长快，导致抑菌率均偏低，6 h后随着各防腐剂溶解量的增加，防腐效果逐步体现，12 h时各防腐剂的抑菌率达到最高点，抑菌作用最强的是苯甲酸乙酯和苯甲酸丙酯，在12 h后仍能保持近90%的抑菌率；苯甲酸丁酯由于烷基碳链的增长，亲油性越强，因而苯甲酸丁酯的水溶性要低于苯甲酸乙酯和丙酯，在最低抑菌浓度下实际起防腐作用的防腐剂量也小，在以水为主体的培养基中发挥作用比较小，所以12 h后苯甲酸丁酯的抑菌率开始下降；苯甲酸和苯甲酸钠的抑菌率最弱。
    3 ·结论
    溶解性是防腐剂发挥抗菌作用的前提，苯甲酸酯类随着酯化程度和酯链长度的增加，抗菌效果显著增强，但苯甲酸丁酯的水相溶解度要比苯甲酸乙酯、苯甲酸丙酯低，影响了它抗菌性的发挥，所以在最低抑菌浓度下实际起防腐作用的防腐剂量也小，它的抗菌效果要差些。
    苯甲酸经酯化后抑菌强度显著增强，抑菌范围受pH影响不大，抑菌稳定性大大提高，具有一定的开发应用前景。

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