金针菇多糖抑菌作用的研究

来源：食品添加剂供求网发布时间： 9/9/2016 9:42:03 AM

    金针菇（Flammulina velutipes）富含蛋白质、碳水化合物、矿物质元素、维生素和粗纤维，含脂肪较低，是一种不可多得的高营养食品[1]。由于其含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、火菇素、倍半萜等多种生物活性物质[2]，而被认为具有很高的药用价值。金针菇多糖是金针菇的主要活性成分之一，具有抗肿瘤和免疫调节作用。
    近年来，由于天然提取物的安全优势，开发和利用天然防腐剂已成为发展趋势。同时由于食品种类繁多，微生物性状各异，现有防腐剂还不能满足食品工业迅速发展的需求，因此寻求广谱、高效、低毒的新型防腐剂是目前食品科学研究之一[3-4]。
    多糖是构成生命的四大基本物质之一，具有抗疲劳、抗肿瘤、抗白血病作用，抗衰老，延长寿命，提高机体的免疫力[5]。研究表明[6-7]，多糖具有抑菌作用，目前国内外关于金针菇多糖研究报道主要集中在金针菇多糖的提取，而对金针菇多糖抑菌活性的研究尚未见相关报道。本试验通过研究金针菇多糖对细菌、真菌的抑菌作用，旨在开发一种天然的食品添加剂。
    1· 材料与方法
    1.1 材料与试剂
    优质金针菇：福建农业职业技术学院食用菌基地提供，后用蒸馏水清洗，自然晾干，粉碎。
    细菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylosocus aureus）；真菌：木霉菌（Trichodermaspp）、青霉菌（Penicillium）、毛霉（Mucor）、镰刀菌（Fusarium）。
    菌株由福建农业职业技术学院微生物实验室提供。培养细菌用牛肉膏蛋白胨培养基[8]，真菌用PDA 培养基[8]。
    乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
    1.2 仪器与设备
    YXQ-SG46-280A 手提式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UV-2800 型紫外可见分光光度计：尤尼克（上海）仪器有限公司；LGR10-4.2高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；HZP-250型全温振荡培养箱：上海新诺仪器设备有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪：上海天呈科技有限公司；BOXUN 超净工作台：上海优浦科学仪器有限公司。
    1.3 方法
    1.3.1 金针菇多糖样品的制备
     金针菇经过粉碎后，采用微波协同酶法提取[9]3次，离心分离后合并上清液，用Sevag 法[10]多次脱蛋白至蛋白质除尽为上，透析，旋转蒸发浓缩，加4 倍体积95 %乙醇沉淀，离心，沉淀物用无水乙醇洗涤纯化，冷冻干燥得金针菇多糖粗品。
    1.3.2 供试菌株活化[11]及菌悬液的制备
    将所有供试菌种接入斜面培养基，细菌置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，真菌于28 ℃培养48 h 后。然后分别挑取1 环已活化好的菌种放入9 mL 无菌水中，振荡摇匀，制成一系列菌悬液，菌浓度约为106CFU/mL～108 CFU/mL，备用。
    1.3.3 金针菇多糖抑菌活性测定
    采用滤纸片法[12]。用打孔器将滤纸打成直径8 mm圆片，滤纸经高压灭菌后，置于500 g/L 多糖及无菌水浸泡30 min。倒入各种菌种的固体培养基，待其完全冷却凝固后，再分别移取各菌悬液0.4 mL，用涂布器涂布均匀。每个平板放4 个实验样片，1片阴性对照样片，用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25 mm 以上，与平板的边缘相距15 mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，细菌置37 ℃培养24 h，真菌28 ℃培养48 h后，观察并测量抑菌圈的直径，分别测定3 次。以无菌水为空白对照。
    1.3.4 金针菇多糖最小抑菌浓度（MIC）测定
    采用二倍稀释法，用无菌水配制成不同质量浓度的溶液，依次为500、250、125、62、31 g/L。向平皿中分别移取不同浓度的稀释液各1.0 mL，然后每平皿中倒入各种菌种相应的温度在45 ℃左右的培养基约14 mL，混匀，完全冷却凝固后，每皿分别移取各菌悬液0.4 mL，涂布均匀，同时做溶剂空白对照。在适宜温度下培养，每个质量浓度作3 个重复。以完全无菌生长的浓度为最小抑菌浓度。
    1.3.5 防腐试验
    猪肉、茄子、豆腐切成小块煮熟，分别用金针菇多糖溶液（浓度为500 g/L）浸泡10 min 后，分装于经过灭菌的培养皿中，置于30 ℃下培养48 h，观察食品感官变化情况。用无菌水作空白对照。
    2· 结果与分析
    2.1 金针菇多糖抑菌效果
    2.1.1 抑菌圈大小（质量浓度为500 g/L）
    按1.3.3 测得金针菇多糖对细菌和真菌抑菌圈大小如表1。

    表1 结果表明，金针菇多糖对真菌的抑菌作用优于细菌，对细菌的抑菌圈直径最大的是31.9 mm，而对真菌的抑菌圈直径最大的是43.1 mm，多糖对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果的差别不明显，对真菌的差别也不明显。金针菇多糖对8 种菌的抑制作用大小依次为青霉菌＞毛霉＞镰刀菌＞沙门氏菌＞木霉菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌。
    2.1.2 最小抑菌浓度（MIC）
    按1.3.4 测得金针菇多糖最小抑菌浓度（MIC）如表2。

    表2 结果表明，金针菇多糖对青霉菌的MIC 最低，为31 g/L，表明金针菇多糖对青霉菌的抑菌效果最好；对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC 最高，为500 g/L，对革兰氏阳性菌和阴性菌的MIC 不存在明显的差别，对真菌的MIC 普遍低于细菌，说明金针菇多糖对真菌的抑菌作用优于细菌。
    2.2 金针菇多糖对食品的防腐作用
    金针菇多糖对食品的防腐作用见表3。

     表3 结果表明，经金针菇多糖处理过的胡萝卜、豆腐和猪肉，其质地、色泽和气味无明显变化，表面无菌斑；但未经金针菇多糖处理的胡萝卜、豆腐和猪肉都腐败变质，表面有菌膜，有酸臭味。因此金针菇多糖对食品防腐具有一定作用。
    3· 结论
    金针菇多糖对细菌、真菌具有一定的抑制作用。不同浓度金针菇多糖的抑菌活性存在极显著差异，以浓度为500 g/L 的多糖溶液的抑菌作用比较明显。金针菇多糖对不同细菌和真菌的抑制活性存在显著差异。金针菇多糖对真菌的抑制活性强于细菌。同时金针菇多糖对食品防腐具有一定的作用。因此，金针菇多糖抑菌作用在食品防腐保鲜中的应用研究具有广阔的前景。但对于金针菇多糖的抑菌机理还有待于进一步研究。

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