不同防腐剂对纤维素酶防腐作用效果的研究
随着工业化的发展，能源短缺和能源消费所引起的环境问题已经成为制约我国可持续发展的瓶颈之一，可替代的、清洁的、可再生能源的研究已成为迫切需要。以纤维素类生物质为原料生产第2代燃料乙醇-纤维素乙醇已被广泛认可[1-3]，并已建成了数个产业化示范厂，纤维素水解为酵母可利用单糖途径主要分酸水解和酶水解，由于酸水解对设备要求高、废水处理难度大等种种原因，目前大多采用反应条件较为温和的酶水解工艺[4-6]，因而纤维素酶的生产直接影响纤维乙醇的发展。在纤维乙醇产业化推广过程中，酶储存过程中染菌污染问题及稳定性显得尤为突出，选择既能防止杂菌污染又不影响酶稳定性的防腐剂，不仅有利于酶的长期储存，在纤维乙醇生产中避免酶解过程由添加酶所带来的外源污染，提高酵母可利用糖含量，从而从降低染菌的角度提高原料利用率。食品防腐剂早已广泛应用于诸多行业[7-9]，试验研究了添加不同防腐剂对纤维素酶的影响，以期为纤维素酶的长久储存提供技术支持，同时更好推进纤维乙醇产业化。
1· 材料与方法
1.1 材料与试剂
纤维素酶浓缩液：河南天冠纤维乙醇有限公司生物酶生产基地，由木霉发酵法生产，发酵液经板框过滤、超滤浓缩得待测酶液。
苯甲酸钠、山梨酸钾、氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV1200型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TDM低速离心机：上海沪湘仪公司；FE20pH计：上海梅特勒公司；恒温振荡器：常州国华电气有限公司。
1.3 酶活力测定方法[10]
参照QB 2583—2003纤维素酶制剂滤纸酶活力测定方法。
1.4 防腐试验
先通过单因素试验确定适宜的防腐剂类别，具体做法：将浓缩后酶液分别取200 mL置于灭菌的500 mL三角瓶中，将不同防腐剂分别加入酶液中，封口。使其终浓度达到设定浓度梯度，每一浓度梯度做3个平行，其后将酶液置于25 ℃条件下放置30 d，取样，测定酶活力和观察菌落总数、溶液澄清度，确定防腐剂类别。然后进行不同类别防腐剂的混配，以确定最佳防腐剂组合；具体做法同单因素试验，放置阶段，每月取样1次，测定周期为90 d。
酶活残留率(%)=(处理后酶活/原始酶活)×100
2 ·结果与分析
2.1 不同防腐剂对纤维素酶防腐效果
由表2可以看出，苯甲酸钠、山梨酸钾、氯化钠等低浓度下不能对纤维素酶起到防腐效果，随着浓度提高，其防腐效果明显增强；尼泊金酯类防腐剂在低浓度下防腐效果明显。但从酶活保留率上看，除氯化钠外，其余防腐剂随着浓度的提高，酶活残留率迅速降低，甚至低于对照组；分析认为苯甲酸钠、山梨酸钾及尼泊金酯类防腐剂主要通过破坏微生物的细胞膜，抑制微生物细胞内酶系的活性，起到防腐作用[11-13]，推测该类防腐剂可能对纤维素酶的活性中心构象具有破坏作用，从而导致酶活力的迅速下降。氯化钠的防腐作用通过形成高渗溶液导致微生物细胞脱水死亡[14]，诸多研究表明，氯化钠作为酶的稳定剂使用可大大提高酶稳定性，本试验中氯化钠的稳定作用效果与文献报道相一致[15-16]。
2.2 优化防腐剂组合的确定
根据单因素试验选择基本达到防腐效果且酶活力损失较小的几种防腐剂进行组合添加，如表3所示，通过试验苯甲酸钠/氯化钠分别以0.10%、7.0%添加，既能达到防腐效果且酶活力损失最低。而山梨酸钾与氯化钠组合虽防腐效果明显，但酶活力残留率低，加之从经济成本考虑，山梨酸钾价格高于苯甲酸钠，并不适宜于工业化生产中大规模使用。
3· 结论
试验表明，单独添加防腐剂或添加单一防腐剂在纤维素酶的防腐效果上不如对不同防腐剂进行复配，组合添加；同时选择既能防腐又可提高酶蛋白稳定性的试剂，可大大降低防腐成本。当苯甲酸钠0.10%、氯化钠7%组合添加下，既能发挥明显的防腐作用，又能提高纤维素酶的稳定性。文献报道[17]，苯甲酸钠、山梨酸钾在酸性环境下杀菌效果较好，苯甲酸钠防腐的最佳pH为2.5~4.0，pH大于5.0，杀菌效果减弱。山梨酸钾防腐的最佳pH为3.0，pH为6.0时仍具有抑菌能力。对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙脂属尼泊金酯类防腐剂，尼泊金酯类在pH4~8时的范围内均有良好的效果。酸性纤维素酶发酵结束后，发酵液经过滤浓缩，浓缩酶液酸碱度往往处于酸性环境，故而苯甲酸钠、山梨酸钾这类在酸性环境下防腐作用效果较好的防腐剂在较高浓度下可起到很好的防腐作用，尼泊金酯类防腐剂虽防腐作用强，但对纤维素酶稳定性影响较大。目前各类新型生物防腐剂已研究开发[18-19]，出于成本考虑这类防腐剂并不适宜在纤维素酶的产业化中应用。酶蛋白的稳定性除与酶蛋白自身结构有关外，与酶蛋白溶液水活度、酶浓度、光、稳定剂的添加等因素密切相关。本研究结果显示氯化钠通过增加溶液本身的渗透压杀死或抑制微生物的生长的同时能够提高酶的稳定性。