醋纤丝束油剂中的菌群分析及抑菌剂的筛选
卷烟过滤嘴是用醋酸纤维制成的醋酸纤维，是一种人造纤维，由纤维素用醋酐处理而制成，根据酯化度不同，产品包括一醋酸纤维素、二醋酸纤维素和三醋酸纤维素，其中二醋酸纤维素经抽丝后得到的丝束，是公认最理想的过滤材料，也是当今世界上生产香烟过滤嘴的主要原料。烟用醋纤丝束纺丝生产过程中要使用醋纤丝束油剂，以利于其生产过程中的润滑、集束和静电消除。常用的醋纤丝束油剂是ST-90乳化油剂，它由矿物油和乳化剂等配制而成，是一种食品级的润滑油剂。由于ST-90乳化油剂中含有丰富的养分，以及生产过程中不可避免地有多种细菌和微生物来源，油剂在使用一段时间后逐渐被微生物分解而性能下降，醋纤丝束的应用安全性受到影响。为抑制微生物生长，丝束生产厂家一般都要在ST-90乳化油剂中添加双氧水或其它杀菌剂，添加量平均为0.005%左右。然而，双氧水是一种强氧化性杀菌剂，易与醋酸纤维丝束纤维分子中的纤维素羟基链团发生氧化反应，使得发生氧化反应处的纤维分子链断裂，影响丝束的强度，丝束带在生产运行和滤棒成型过程中受到磨擦作用后，易产生飞花等质量问题。防腐剂作为一类重要的食品添加剂可使食品中的微生物丧失活性，延缓或阻止其生长，在食品工业中被广泛应用[1]。防腐剂可被分为化学防腐剂和天然防腐剂两大类，GB 2760-2011《食品添加剂使用卫生标准》明确规定了27种允许限量使用的食品防腐剂。在实际生产中以化学防腐剂为主，包括苯甲酸钠、丙酸钙、富马酸二甲酯、山梨醇和山梨酸钾等[2]。
所列举防腐剂的一个共同特点为性质较稳定，无味或味道较轻，在使用过程中基本不影响食品的口感。因此，采用食品防腐剂替代双氧水作为乳化油剂的抑菌剂具有一定的可行性。本研究首先采用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术[3]分析使用后的ST-90乳化油剂中微生物种群，在此基础上研究一系列食品防腐剂对该油剂微生物生长的影响，最后提出采用食品防腐剂替代双氧水抑菌的方案。
1·材料与方法
1.1材料与设备
ST-90乳化油剂、微生物污染的ST-90样品南通醋酸纤维有限公司醋纤丝束纺丝生产车间；细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌16S rDNA通用引物（Eub-8fm：AGAGTTTGATCMT GGCTCAG；1492r：GYTACCTTGTTACGACTT）上海生工生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、DNA限制性内切酶、DNA片段纯化试剂盒宝生物工程（大连）有限公司；苯甲酸钠、丙酸钙、富马酸二甲酯、山梨醇、山梨酸钾、脱氢乙二酸、对羟基苯甲酸丙酯北京博凯思维科技有限公司。
BioRad1000系列高性能PCR仪、PowerPace Basic电泳系统、GelDoc凝胶成像系统美国伯乐公司；毛细管电泳仪ABI 310 genetic analyzer美国PerkinElmer公司；恒温培养箱上海医疗器械研究所；空气恒温摇床上海精密仪器仪表有限公司；5804R台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；LS-B50L型立式圆形压力蒸气灭菌器上海医用核子仪器厂；pH计瑞士Mettler-Toledo公司。
1.2实验方法
1.2.1油剂中微生物种群的T-RFLP分析
1.2.1.1总细菌基因组DNA提取将被微生物污染的ST-90样品于10000r/min离心5min，沉淀部分用于基因组DNA提取，操作步骤按上海生工基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
1.2.1.2 PCR扩增16S rDNA以上述总细菌基因组DNA为模板，以16S rDNA通用引物（Eub-8fm和1492r）扩增细菌基因的16S rDNA序列。PCR条件：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，90s；30个循环。
1.2.1.3 16S rDNA PCR扩增产物的分析分别利用DNA限制性内切酶HhaⅠ酶切16S rDNA PCR产物。酶反应条件：37℃，2h。酶切产物于65℃处理20min终止酶切反应，并用DNA片段纯化试剂盒纯化。
1.2.1.4酶切片段的长度分析酶切片段的长度分析由上海基康生物技术有限公司完成。将2μL酶切液样品、10μL甲酰胺、1μL内标充分混合，于95℃变性4min，迅速置于冰浴中，所得变性液进行毛细管电泳。电泳条件：胶型为POP4，电泳时间为30min。电泳结果用ABI PRISM GeneScan Analysis Software Version3.7进行分析。
1.2.1.5酶切片段的长度分析基于毛细管电泳数据，利用美国爱达荷州大学微生物种群分析系统MiCA（http：//mica.ibest.uidaho.edu/）分析被微生物污染的ST-90样品中的优势细菌。
1.2.2 ST-90乳化油剂抑菌剂的筛选
1.2.2.1固体培养的抑菌实验将ST-90乳化油剂用去离子水稀释50倍后配制固体琼脂培养基，于115℃灭菌15min。用相同方法将已使用的ST-90乳化油剂稀释50倍，取0.5mL涂布于上述固体培养基，于30℃恒温培养5~10d；进行抑菌实验时，向培养基中添加一定浓度的抑菌剂。以每平板长出的菌落数作为抑菌效果的评价指标。
1.2.2.2液体培养的抑菌实验将ST-90乳化油剂用去离子水稀释50倍后配制液体培养基，于115℃灭菌15min。用相同方法将已使用的ST-90乳化油剂稀释50倍，取0.5mL接种至25mL上述液体培养基，于30℃，200r/min摇床培养30d；进行抑菌实验时，向培养基中添加一定浓度的抑菌剂。以液体培养的菌体干重作为抑菌效果的评价指标。
1.2.2.3抑菌效果的验证将已污染的ST-90乳化油剂用去离子水稀释50倍，取0.5mL接种至25mL未灭菌的ST-90乳化油剂，于30℃，200r/min摇床培养30d；进行抑菌实验时，向培养基中添加一定浓度的抑菌剂。持续取样，采用平板计数测定ST-90乳化油剂中的活菌数。
2·结果与讨论
2.1微生物种群分析
2.1.1 T-RFLP分析的原理由于每种微生物的细胞都具有自己的基因组DNA，其核苷酸序列组成也具有各自独特的特征。因此，通过直接从环境样品中提取所有微生物的基因组总DNA，依据核苷酸进化指针序列（16S/5.8S rRNA基因序列）的不同，分析这些DNA的种类和相对数量，就可以反映出微生物的种类组成以及种群数量比例情况，为选择高效的抑菌剂提供充分依据。与以纯培养技术为基础的微生物种群研究方法相比，基于样品菌群DNA特征的分析方法可更真实反映样品中的菌群分布。
本实验采用T-RFLP来研究被污染ST-90乳化油剂中的细菌种类。其原理是根据菌群基因组保守区设计通用引物，其中一个引物的5’末端用荧光物质标记。提取油剂中菌群的总DNA，以之为模板PCR扩增细菌16S rDNA，得到的PCR产物的一端带有这种荧光标记。然后，用合适的限制性内切酶切割PCR产物。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。不同长度的末端限制性片段代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反映油剂微生物群落组成情况。
2.1.2样品总基因组DNA提取及扩增16S rDNA琼脂糖凝胶电泳分析显示，从被污染的油剂中分离得到高质量的菌群总DNA（图1）。同时，利用16S rDNA引物从该总DNA中成功扩增得到大小约为1.5kbp单一基因片段（图1），与所用引物对应的细菌16S rDNA理论大小基本一致。
2.1.3 16S rDNA毛细管电泳分析为获得ST-90乳化油剂样品中各菌株的特征基因片段，选取DNA限制性内切酶HhaⅠ切割16S rDNA的PCR产物。琼脂糖凝胶电泳显示，酶切反应得到一系列DNA片段（图2）。由图2可知，16S rDNA PCR产物的酶切产物超过54个吸收峰（结果未标出）；其中，10个峰较明显。上述结果表明，污染油剂样品中至少含54种细菌；其中，10种细菌为优势菌群。利用美国爱达荷州大学提供的微生物种群分析系统MiCA分析发现，该油剂中含量排前6位的细菌包含于两个属，分别为Dysgonomonast和Dehalococcoide（s表1）。Dysgonomonas属于拟杆菌目中的紫单胞菌科，占油剂中细菌总量的40%以上（表1）。而Dehalococcoides属于Dehalococcoidetes纲，占油剂中细菌总量的20%以上。细菌Dehalococcoides主要通过氧化氢气并对有机物进行还原性脱卤酌而获取能量以维持其正常生长[4]。最早报道于1997年的Dehalococcoides菌是Dehalococcoides ethenogenesstrain 195，它是已知细菌中唯一能将脱氯地下水中两种最普遍的污染物（四氯乙烯和三氯乙烯）转化成无毒的代谢物乙烷的细菌[4]。
2.2抑菌剂筛选
2.2.1抑菌剂种类的优化依据GB2760-2011《食品添加剂使用卫生标准》各食品防腐剂的最大用量，选用苯甲酸钠、丙酸钙、富马酸二甲酯、山梨醇、山梨酸钾、脱氢乙二酸和对羟基苯甲酸丙酯等进行抑菌实验。为尽可能接近在醋纤丝束纺丝生产过程中油剂微生物的生长环境，以稀释的ST-90油剂为培养基于30℃培养油剂微生物（见1.2.2）。如图4-A所示，含有苯甲酸钠（2.5g/L）或富马酸二甲酯（0.05g/L）的固定培养基上生长的菌落数少于15个/平板，远低于不含抑菌剂的培养基的菌落数（92个/平板）；含有其它抑菌剂的固体培养基的菌落数均超过30个/平板。在液体培养中（图4-B），含有苯甲酸钠（2.5g/L）或富马酸二甲酯（0.05g/L）的培养基中的菌体干重均少于0.1g/L；其它培养条件下菌体干重超过0.4g/L。因此，苯甲酸钠和富马酸二甲酯可明显抑制菌体生长，是理想的油剂微生物抑制剂。
2.2.2抑菌剂浓度的优化为降低应用成本，在保证抑菌效果的前提下，抑菌剂浓度越低越好。因此，需对苯甲酸钠和富马酸二甲酯的有效抑菌浓度进行优化。由于选用的食品防腐剂在油剂微生物固体培养和液体培养过程中的抑菌效果具一定的正相关性（图4），故采用易于操作的固体培养进行抑菌剂浓度的优化。如图5所示，苯甲酸钠浓度在1.0~2.0g/L，油剂微生物菌落数接近40个/平板；富马酸二甲酯浓度低于0.04g/L时，则可以抑制菌体生长油剂微生物菌落数超过40个/平板。上述结果表明，苯甲酸钠与富马酸二甲酯需在接近其最大允许浓度下才能较好地抑制油剂中的微生物。
2.2.3抑菌剂组合的优化为降低人体接触香烟滤嘴时对单一防腐剂的摄入量，本实验研究了苯甲酸钠和富马酸二甲酯组合对油剂中微生物生长的抑制效果。如图6所示，含有1g/L苯甲酸钠与0.03g/L富马酸二甲酯或1.25g/L苯甲酸钠与0.025g/L富马酸二甲酯或1.5g/L苯甲酸钠与0.01g/L富马酸二甲酯的固定培养基的菌落数在10个/平板以下。结果表明，通过优化两种食品防腐剂的组合，可降低单一防腐剂的用量，而抑菌效果不变。
2.2.4抑菌剂组合的效果验证为进一步验证食品防腐剂的抑菌效果，测定了含有上述优化的苯甲酸钠与富马酸二甲酯组合的ST-90乳化油剂中微生物在30℃下的生长情况。结果显示，30d内在含有组合抑菌剂的ST-90乳化油剂中未见菌体明显生长，而不含抑菌剂的ST-90乳化油剂中的菌体生长较为显著（图7）。
3·结论
本研究首先采用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析方法对使用后的ST-90乳化油剂中微生物种群进行分析，在此基础上研究一系列食品防腐剂对该油剂微生物生长的影响，最后提出采用食品防腐剂替代双氧水抑菌的方案。菌群分析表明，ST-90乳化油剂中的细菌超过170种，主要由Dysgonomonast属和Dehalococcoides属的细菌组成。抑菌实验的结果显示，在固体培养和液体培养条件下，2.5g/L苯甲酸钠和0.05g/L富马酸二甲酯可明显抑制菌体生长。苯甲酸钠与富马酸二甲酯同时添加且其含量分别为1与0.03g/L、1.25与0.025g/L或1.5与0.01g/L，ST-90乳化油剂中微生物在30d内未见明显生长。
双氧水作为一种廉价有效的防腐剂被用于部分食品的加工过程，其对人体的危害得到越来越多的重视[5]。醋纤丝束生产过程中与含有双氧水的油剂接触必然造成一定浓度的双氧水在醋纤丝束中的残留。作为香烟滤嘴主要原料的醋纤丝束虽未被食入体内，残留双氧水对人体的潜在危害仍应引起足够重视。本研究结果初步表明，采用食品防腐剂来替代双氧水抑制醋纤丝束油剂中微生物的生长具有良好的效果，即油剂中的微生物对食品防腐剂敏感。因此，采用食品防腐剂是提高香烟滤嘴安全性的重要策略。目前，来自动物、植物和微生物的天然防腐剂越来越多地被应用于食品工业，其较传统的化学防腐剂具有更高的安全性[6]。将天然防腐剂应于醋纤丝束加工过程是将来的一种发展趋势。