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非水相酶催化技术在食品添加剂生产中的应用

     自20世纪80年代以来，非水相酶催化技术快速发展。与传统的以高温高压、高能耗、重污染以及无选择性为特征的化学催化工艺相比，非水相酶催化反应具有许多优点，如反应条件温和、易于控制、选择性高、无二次污染、专一性强等。且反应过程能耗低，安全性高，极好地符合“低碳经济”和可持续发展原则，也是当前“绿色化学”过程研究的热点。
    目前，非水相酶催化技术已广泛应用于手性药物、高分子材料、表面活性剂合成等领域。食品添加剂的绿色制造是现代食品工业的主要领域与核心技术之一。随着政府环境保护力度的加大、消费者对食品和日用品安全性的重视，并鉴于非水相酶催化反应的优势，该技术生产食品酸味剂、食用香料、维生素类营养强化剂等重要的食品添加剂的研究逐渐增多。笔者就非水介质的发展进行了综述，并介绍了该技术在(异)抗坏血酸酯、短链酸酯、糖酯、维生素A酯和维生素E酯等新型食品添加剂非水相酶催化合成的关键步骤。
    1·非水相酶催化反应介质
    反应介质对酶的活性、选择性、稳定性、酶的动力学和底物与产物的扩散作用都会产生影响。而非水相生物催化的反应介质并非完全无水体系，非水反应介质是指以有机溶剂为主的介质、气态反应介质、超临界流体和离子液体等，还可以是包括水和有机溶剂组成的均相或非均相体系，添加表面活性剂的乳状液或微乳液体系，以区别于传统以水为主的催化介质。用于酶催化的非水介质主要包括以下几种。
    1．1微水有机溶剂单相系统(Nearly anhydrous organicsolvent system)微水有机溶剂系统是指用水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水(＞98%)，形成固相酶分散在有机溶剂中的单相系统。酶处在这种系统中，其表面必须有残余的结构水，才能保证酶的催化活性，因此一般有机溶剂中含有小于2%的微量水。在这个系统中，需要通过冻干法，固定化法或者两亲化合物修饰来增强酶的溶解性［1－2］。系统中的水含量(水活度)对酶活性影响显著［3－4］。一般来讲，酶在疏水溶剂中比亲水溶剂中可能有更高的活性。低含水量系统中，酶构象的流动性常受限制，因此在这个系统中蛋白质结构会比在水中变得更加“刚硬”。
    1．2水+与水互溶的有机溶剂系统(Water+water-misci-ble organic solvent system)加入与水互溶的有机助溶剂可提高亲脂性底物在水溶液反应体系中的溶解度［5］。助溶剂可以显著地降低传质阻碍，提高疏水性化合物的反应速率，并有利于酶促催化过程。但有机助溶剂浓度的增加会降低酶的活性，因此高酶活性的作用会被底物溶解度的提高抵消［6］。常用的助溶剂包括二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氧六环(dioxane)、丙酮和低级醇等。
    1．3水+与水不溶的有机溶剂系统(Water+water-immis-cible organic solvent system)水+与水不溶的有机溶剂系统是由水相和非极性有机溶剂相组成的非均相反应体系。
    水相形成隔离层与有机溶剂相层通过界面区域连接。在这个系统中，酶促反应在含有酶的水相中进行，疏水性底物如甾体或脂肪等大部分都存在于有机溶剂层中，与水相分开。底物通过酶转化后，产物又被萃取到有机溶剂相中。这个系统有利于肽和酯的合成，因为此反应的转化平衡倾向于合成方向［6］。两相催化系统有利于酶回收、产物分离和减少酶与有机溶解的直接接触。但由于底物和产物需通过界面区域，导致传质速率降低，最终降低了反应速率［7－8］。
    1．4反胶束系统(reverse micelle system)反胶束系统是含有表面活性剂与少量水的油包水(W/O)有机溶剂系统。表面活性剂可以是阳离子型、阴离子型或非离子型，常用的AOT［丁二酸二(2-乙基)己酯磺酸钠］、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、卵磷脂和吐温等［9］。反胶束极性内核中的水与常态水物理性质不同，黏度较高，酸度低，所以可使溶解性低的底物溶解［10］。反胶束体系中的含水量是影响酶活性的关键因素。水相的pH通过改变酶表面的电荷直接影响酶的催化活性和构象［11］。近年来，反胶束应用在非水相酶催化反应的前景广阔。
    1．5超临界流体系统(supercritical fluid system)超临界气体［二氧化碳、氟里昂CF3H，烷烃类(甲烷、乙烯、丙烷)或无机化合物(SF6，N2O)等］都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂［12］。超临界气体溶剂体系无毒、低黏度、产物易于分离。超临界气体的黏度介于气体与液体之间，其扩散性比一般溶剂高1～2个数量级。超临界气体在临界点附近的温度或压力有一点微小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调控超临界气体中酶催化反应的特性，如反应速率和选择性［13］。如在酶法水解叶黄素内酯的反应中，对比甲苯和正辛烷，CO2超临界流体为反应介质的水解效率最高，这可能是由于CO2超临界流体具有高扩散性、低黏度和低表面张力的缘故［14］。
    1．6离子液体(Ionic liquid)离子液体由有机阳离子和无机或有机阴离子构成，在室温或室温附近温度下呈液态，不易挥发，不会造成环境污染，被称为绿色溶剂。离子液体无蒸气压、安全性和溶解性好、热稳定温度范围宽、可以与多种溶剂组成双相体系，在酶促有机反应中的应用可以很好地解决酶的固定化及酶在有机溶剂中失活的问题。各种对有机溶剂有良好耐受性的脂肪酶，在离子液体中有相当于或好于有机溶剂中的活性，而且在离子液体中的热稳定性、操作稳定性和区域、对映体选择性都有所增加。离子液体的这些特征拓宽了溶剂工程的应用范围，成为生物催化和转化的“新宠”介质［15］。如Laszalo等应用离子液体［Bmim］PF6和［Amim］PF6反应体系，以α-糜蛋白酶催化了N-乙酰基-L-苯丙氨乙酯和1-丙醇之间的酯交换反应［16］;Erbeldinger等研究了离子液体体系［Bmim］PF6/H2 O中嗜热菌蛋白酶催化合成Z-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的反应［17］;Lozano等在［Emim］BF4中用CaLB(Nov 525)催化丁酸乙烯酯和1-丁醇的转酯化反应，反应速度相当于或好于在有机介质1-丁醇中［18］。
    1．7无溶剂反应系统(solvent-free system)无溶剂系统是指以底物作为溶剂，没有其他溶剂参与。通常在此系统中，底物浓度高、反应速度快、转化效率高、节省溶剂、无污染，并避免了溶剂使用和回收等问题。如T Chatterjee等用脂肪酶在无溶剂系统下合成萜烯酯，保证了产物的天然风味和合成过程的绝对“绿色”［19］。同时，无溶剂法能有效节省成本和简化分离纯化步骤。无溶剂反应系统与其他反应系统相比具有明显的优势，但局限于底物为液态的酶催化反应，在实际应用中仍受到较大的限制。
    2·非水相酶催化技术合成食品添加剂
    目前，利用非水相酶催化技术合成的食品添加剂主要是在非水介质中脂肪酶催化下合成的脂肪酸酯和糖酯等酯类。选择合适的功能基团，如具有亲油性的长碳链，通过非水相酶催化技术分别对底物衍生化，得到酯化衍生物，既保留着原有的亲水性和生物活性，又增加了亲油性或其他生物活性基团，扩大原食品添加剂的应用范围。这里介绍几种在食品行业比较重要的并利用非水相酶催化技术合成的新型添加剂。
    2．1 L-抗坏血酸与D-异抗坏血酸脂肪酸酯的合成抗坏血酸和异抗坏血酸有很强的还原能力，在食品和化妆品中被用作抗氧化剂，但由于它们的脂溶能力差，大大限制了它们的应用范围，因此只有将它们转化为脂肪酯才能在油性食品中起到抗氧化作用。酶法合成较化学合成具有反应条件温和、反应特异性强、产品易分离，对环境危害小等特点。1991和1992年，Enomoto等在《美国专利》上发表了2篇文章介绍了抗坏血酸与异抗坏血酸在有机溶剂中通过酶法酯化或转酯化合成抗坏血酸和异抗坏血酸有机酯［20－21］。
    过去十几年，学者主要研究脂肪酶的种类和溶剂的极性对酯化作用的影响。溶剂极性参数用logP(logP是该有机溶剂在正辛醇/水体系中分配系数的对数)表示。20世纪90年代，国外就对酶的种类和溶剂极性对酯化作用的影响进行了深入的研究，抗坏血酸与棕榈酸的酯化作用可以通过AmanoP脂肪酶或南极洲假丝酵母脂肪酶在丁酮、吡啶、二氧六环、四氢呋喃或者2-甲基-2丁醇中催化进行［22］。Stamatis等研究发现，南极洲假丝酵母脂肪酶催化抗坏血酸与对羟基苯乙酸的反应和根毛均属催化抗坏血酸与肉桂酸的反应都有很高得率［23］。南极洲假丝酵母脂肪酶更适合用于生产抗坏血酸脂肪酸酯，抗坏血酸与脂肪酸在2-甲基-2-丙醇中在24 h内产率就达到65%以上。Youchun等用脂肪酸乙烯酯代替脂肪酸合成L-抗坏血酸脂肪酸酯，脂肪酶选用诺维信公司的Chirazyme L-2，以丙酮为溶剂，在40℃下进行催化酯交换反应，48 h后6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸纯化得率为91%［24］。汤鲁宏等对L-抗坏血酸棕榈酸酯的合成进行了研究［25］。结果发现，在所研究的几种反应介质中，叔戊醇是最佳的反应介质，说明脂肪酶在0＜logP＜2的溶剂中活性较高。在所研究的几种脂肪酶中，南极假丝酵母脂肪酶表现出了良好的催化活性，根毛菌属脂肪酶也有一定活性，其余酶种无催化活性。刘长波等在研究酶促合成L-抗坏血酸棕榈酸酯时，也对脂肪酶和溶剂体系进行了考察［26］。研究发现，南极洲假丝酵母脂肪酶在叔丁醇仿水溶剂体系中有很好的催化活性，而且受溶剂中水含量变化的影响较小。宋秋红以L-抗坏血酸和脂肪酸为反应底物合成L-抗坏血酸脂肪酸酯，用脂肪酶Candida sp．99-125在丙酮和叔丁醇混合溶剂体系中有很好的催化活性，并确立了最适反应条件［27］。彭杨等采用猪油和抗坏血酸为原料，研究超声作用对酶促转酯化反应合成抗坏血酸脂肪酸酯的影响，并确定了以叔戊醇为溶剂，Novozym 435用量20%(抗坏血酸质量百分比)，抗坏血酸与猪油物质的量的比1∶3，超声功率350 W，超声频率59kHz，反应时间9 h，抗坏血酸脂肪酸酯转化率达到88．00%［28］。超声条件下Novozym 435有良好的操作稳定性，反应6批次后，酶活还保持在比较高的水平。
    2．2短链酸乙酯的合成短链酸乙酯作为香味化合物是天然香味物质的一部分，具有多种天然水果的香味和特殊的风味特征。短链酸乙酯一般是通过化学合成法合成，即在一种强酸(如硫酸)作催化剂下醇与有机酸合成酯，或者是从天然产物中提取出来。目前全球短链酸乙酯大部分都是从传统的化学合成法中生产的，化学合成法与酶促催化酯化法生产的产品的安全性和品质等方面存在较大的差异，酶促催化酯化法可以代替化学合成法制备脂肪酸酯和其他的香味物质，酶法合成的反应条件温和，所得到的产品被食品监管机构认定为天然产物，与化学合成法相比，增加了在食品行业中的公众认可度。
    徐大刚等研究了用脂肪酶非水相生物催化合成己酸乙酯，原料为正己烷、己酸和乙醇［29］。最佳反应条件是在正己烷中加入浓度为0．15 mol/L的己酸和0．10 mol/L的乙醇，加入质量浓度为0．01 kg/L脂肪酶CLL，采用MgCl2控制水分，用反渗析膜隔开，在25℃、100 r/min振荡水浴中反应24 h，脂肪酶合成己酸乙酯转化率可达99．07%。deBarros等主要研究了短链乙酯的酶促合成，在异己烷中cutinase脂肪酶催化下评价了不同的参数对反应得率的影响［30］。反应6 h后，丁酸乙酯的最高得率达到84%，戊酸乙酯达到96%，己酸乙酯达到97%。曾家豫等研究了有机介质中CRL脂肪酶催化己酸与无水乙醇合成己酸乙酯的酯化反应条件，合成的产物为己酸乙酯，纯度为96．91%［31］。酯化反应在以正庚烷为反应介质，反应温度为311 K，己酸与无水乙醇的摩尔比为1∶1．3，己酸浓度为0．2 mol/L的条件下，反应24 h后，转化率达到94．6%。Han等研究了在非水介质中由暴露在酿酒酵母全细胞上的CALB催化高效合成己酸乙酯［32］。在重组的酿酒酵母细胞表面上连接上CALB(南极洲假丝酵母脂肪酸B)，用于全细胞生物催化己酸和乙醇发生酯化反应合成己酸乙酯，并且研究了影响酯化反应的各个参数，得到最佳的反应条件是:反应温度是40℃，己酸浓度0．2 mol/L，己酸和乙醇的比率是1∶1．25和细胞数量为60 g/L(干细胞17 U/g)，3分子筛加入到反应介质中。在此最适条件下，反应12 h后产率高达98．2%。张艳等研究了有机溶剂中猪胰脂肪酶催化正己酸和无水乙醇合成己酸乙酯的反应［33］。以正己酸和无水乙醇在各种反应介质中进行酶催化反应，考察反应介质、底物浓度、底物摩尔比、加酶量、反应时间对产率的影响。研究得到最适反应条件为以环己烷为反应介质，正己酸浓度0．6 mol/L，n(正己酸)∶n(无水乙醇)为1∶1．25，加酶量15g/L，反应温度37℃，反应24 h后，产率达到90．5%。2．3糖酯的合成糖酯作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。高级脂肪酸的糖酯是一种高效无毒的非离子性的表面活性剂，它广泛应用于食品、医药、发酵及石油化学工业领域。酶法合成的葡萄糖酯、果糖酯、山梨醇酯不仅具有表面活性，并且具有抗肿瘤和植物生长抑制活性。
    目前市场上的糖酯产品大多数是采用化学合成法合成的，合成反应在高温、高压、强酸下进行，条件较苛刻，产物带有颜色，而且催化反应选择性差，有很多的副产物生成。而酶法合成反应条件温和，色泽浅、产品易于纯化;且酶具有高立体选择性、区域专一性和位置选择性。糖酯作为一种多羟基的物质，其多羟基的位置选择性酯化是有机合成化学中的难题之一。因此，研究脂肪酶催化糖类酯化的位置选择性具有重要的意义和广阔的前景。
    Ward等研究了由1，2-O-异丙基-D-木糖和脂肪酸酶法合成糖酯，确立了有脂肪酶催化合成糖酯的最适反应条件［34］。脂肪酶N-435和IM可以使酯化反应达到最大程度，由脂肪酶N-435合成糖酯的最适温度是60℃，当花生四烯酸与1，2-O-异丙基-D-木糖的比例为1～2∶1时，可以得到最大转化率83%～85%。反应结束后酶很容易分离和再生。Xiao等对比研究了在超声和振荡条件下在非水介质中酶法合成葡萄糖酯［35］。研究了溶剂、酶、酰基供体的链长、超声波的能量和间歇超声波对酶促合成的影响。在可选择的8种溶剂中，超声或振荡条件以及枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶存在下，吡啶是最合适的反应介质。催化转酯化的脂肪酶Novozym 435和枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶在超声的加速影响下，增加了酰基供体的链长，减少了C10～C4的酰基供体。同样研究了超声辐射能量(50、100和120 W)和操作方式(连续超声10 min超声、无超声20 min振荡)对转酯化的影响。结果显示，高能量和连续超声可以更好地加速酯化反应。超声不会改变酶在转酯化中的特性和选择性。
    冯雷刚等研究了固定Novo 435脂肪酶在叔丁醇溶液中催化合成葡萄糖月桂酸酯的反应［36］，初步确定了在温度为45℃、pH 7．5、初始水活度0．75、加酶量200 mg、添加分子筛1 g的条件下，酯化率可达65%。
    王栋等发现，来源于假丝酵母的脂肪酶Novozym 435在无溶剂系统中有较高合成失水山梨醇单油酸酯(Span 80)的能力［37］。同时考察了水分对酯化反应的影响，并对酯化反应的条件如底物摩尔比、用酶量等进行了研究。与化学合成的产品比较，各项指标基本接近，且酶法合成的产品单酯含量较高，达80%以上。失水山梨醇单油酸酯可通过脂肪酶CAL在无溶剂体系中转化合成。
    Ye等研究了在65℃条件下，无溶剂反应系统中通过固定化脂肪酶催化酯化生产糖脂肪酸酯，同时研究了酰基供体(油酸、辛酸、月桂酸和棕榈酸)和受体(果糖、蔗糖、葡萄糖和木糖)对糖脂肪酸合成的影响，得出在填充床生物反应器(PBBR)中以果糖和油酸作为底物可以获得最佳的反应性能［38－39］。
    2．4维生素A脂肪酸酯的合成维生素A及其衍生物在化妆品和制药行业是非常具有商业潜力的，特别是抵抗皮肤疾病，如癌症、光老化、牛皮癣或痤疮。但这些维生素A衍生物极不稳定且对皮肤有刺激性，很容易受到光、空气、氧化剂和热的作用而氧化［40］。现在已经有大量的研究集中于发展合成性质稳定的维生素A酯，如维生素A醋酸酯，性质极稳定，不溶于水但溶于油脂，是一种优良的营养增补剂，现已广泛应用于乳制品、婴幼儿食品、乳及乳饮料中［41］。
    通常，正己烷是维生素A酯合成中普遍使用的有机溶剂。以正己烷为反应介质时，合成维生素A月桂酸酯、维生素A豆蔻酸酯、维生素A硬脂酸酯、维生素A油酸酯、维生素A亚油酸酯和维生素A亚麻酸酯都可以达到较高的转化率。
    刘涛等用自制的固定化脂肪酶，得到的有机溶剂体系中酶促合成维生素A棕榈酸酯的反应条件为:10 ml不含水分的正己烷中，0．200 g维生素A醋酸酯和0．468 g棕榈酸，加酶量为10%，在30℃、190 r/min下反应6 h，转化率可以达到75%，固定化酶可连续使用6次以上［42］。
    Yin等研究了从假丝酵母中得到脂肪酶固定化后在有机溶剂中合成维生素A酯［43］。为了得到合成维生素A棕榈酸酯的最适条件，详细研究了反应中酶的种类、溶剂的影响、底物摩尔比、反应温度、水活性。在正己烷中，向1．2 mmol维生素A醋酸酯和3．6 mmol棕榈酸中加入100 mg固定化假丝酵母脂肪酶，在25℃下12 h内维生素A棕榈酸酯收率达81%。张文娟等研究了超声辐照条件下非水相酶催化维生素A棕榈酸酯［44］。最适反应条件为:10 ml的正己烷溶剂，0．164 g维生素A醋酸酯和0．320 g棕榈酸，酶与维生素A醋酸酯的质量比为1∶4的固定化脂肪酶Novozym 435催化下，超声功率为90 W，反应6 h，酯化率可达82%。
    2．5维生素E脂肪酸酯的合成维生素E也是一种天然的抗氧化剂，在食品保鲜和预防疾病方面起着重要的作用，在肝脏中还可以抑制胆固醇的含量。目前，国内外对非水相酶催化合成维生素E酯的研究刚刚起步，脂肪酶和有机溶剂对酯合成反应的影响还没有充分地了解。
    辛嘉英等研究了脂肪酶催化将脂溶性很强的维生素E和水溶性较强的阿魏酸合成了具有多种生理活性的新型双功能分子，在提高维生素E稳定性同时增加了阿魏酸在油脂工业中的应用范围［45］。反应最适条件为阿魏酸乙酯与维生素E的底物比为1∶5，反应温度45℃，摇床转速150 r/min，初始含水量为零时，产率最高为72．3%。
    Torres等利用酯转化技术，在2-甲基-2-丁醇中将醋酸乙烯酯上的乙酰基转移到维生素E分子上，形成维生素E酯，并论述了反应进行情况与反应物的大小有直接关系［46］。从15种水解酶中仅筛选出南极假丝酵母脂肪酶可催化此酯化反应，研究了3种南极假丝酵母固定化脂肪酶固定化载体:离子交换树脂(novozym 435支持物)、可生物降解的聚合物和聚丙烯。并且发现，以聚丙烯为载体的南极假丝酵母固定化脂肪酶，能更好地催化反应进行。
    3·研究展望
    非水相酶催化技术成为目前酶工程中酶催化反应的研究热点，非水相体系利用脂肪酶合成食品添加剂受到越来越多的重视。但实现非水相酶催化合成食品添加剂的工业化生产还需面临很多问题，如筛选耐有机溶剂的酶、调控非水相中酶活以及降低催化过程成本等。因此，通过技术创新，充分发挥非水相酶催化固有的优势，发展新型食品添加剂非水相酶催化技术，显著提高工艺集成度，大幅度减少合成步骤和复杂性及降低分离纯化难度，将成为我国开发新型食品添加剂快速、可持续发展的必然选择。

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