原花青素脂质体薄膜—挤压法制备及其稳定性研究
原花青素是一种水溶性的天然色素，它广泛存在于自然界植物中，来源非常丰富[1]。原花青素不仅是一种安全、无毒的食用色素，而且具有诸多的药理作用和很高的营养价值，如具有高效地抗氧化和清除人体自由基等作用[2]。因而，原花青素在医药、化妆品、食品等领域有巨大的应用潜力[3-4]。然而原花青素对外界环境，如pH值、温度、光照等因素十分敏感[5]，易于被氧化和破坏，这不仅大大降低了它的价值，而且限制了它的使用。为增加原花青素的稳定性，保持其诸多优点，扩大其开发利用，必须采取一定措施提高原花青素的稳定性[6]。
脂质体是由磷脂双分子层组成，内部为水相，具有类似生物膜结构的闭合囊泡[7]。它的双分子层和内部水相可以包封芯材，同时，双分子层隔开了包封物与外界环境的接触，增加了包封物的稳定性；此外，脂质体还具有靶向性、缓释性、低毒副作用等特点[8]。近年来，脂质体技术在医药、化妆品、食品等领域已展开了广泛地研究[9]。
本工作拟以原花青素为芯材，大豆卵磷脂为壁材，采用薄膜-挤压法制备原花青素的脂质体，优化其制备工艺参数，并进一步研究其体外释放的稳定性，以期为提高原花青素的稳定性及扩大其在食品领域的应用提供理论依据。
1 ·材料与方法
1.1 材料与设备
葡萄籽原花青素：天津尖峰天然产物有限公司；大豆卵磷脂(SPC)：生化试剂，上海锐麟生物科技有限公司；胆固醇(CHOL)、无水乙醚、吐温80(Tween 80)、曲拉通X-100、胆酸盐：中国上海国药集团；葡聚糖凝胶Sephadex G-25：上海Sigma-Aldrich公司；Nuclepore聚碳酸酯膜：杭州雷琪实验器材有限公司；其他化学试剂均为分析级。
磁力搅拌器：上海沪西仪器厂；ZX98-1型旋转蒸发仪：上海有机化学研究所；UV-1600型紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；Nano-ZS型纳米粒度分析仪：英国Malvern公司；TG16-WS型台式高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 薄膜-挤压法制备原花青素脂质体
按配方称取大豆卵磷脂、胆固醇，用15 mL无水乙醚于250 mL梨形瓶中将之充分溶解；在50 ℃水浴中，减压旋转蒸发除去无水乙醚(控制真空度)，在瓶壁上形成均匀的薄膜，然后通入氮气，充分除去残留的有机溶剂。加入溶有适量原花青素、吐温80的磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH6.8)后，继续旋转蒸发30 min进行充分水合，快速冷却；在氮气的压力下，将水合体系挤出微孔滤膜(0.1、0.2、0.3、0.4、0.8 μm)，得原花青素脂质体。
1.2.2 脂质体包封率的测定
采用稍作改进的微柱离心法[10]测定原花青素脂质体的包封率。原花青素脂质体的包封率(EE)由式(1)计算。
EE (%)=(Qe/Qt)×100 ………………………(1)
1.2.3 脂质体粒径测定
根据动态激光光散射技术(DLLS)，用粒径测定仪于25 ℃测定原花青素脂质体的粒径分布。测定条件：He/Ne激光器(λ=633nm)，散射角90 °，折射指数1.33，黏度0.8872mPa·s。悬浮液配制：用0.05 mol/L、pH7.0的PBS缓冲液将脂质体的磷脂浓度稀释至0.1%。
1.2.4 原花青素脂质体在模拟胃肠液中的释放
模拟胃液pH1.3，由HCl、NaCl、胃蛋白酶、去离子水组成；模拟肠液pH7.5，由KH2PO4、NaOH、胰蛋白酶、胆酸盐、去离子水组成。
将10 mL原花青素脂质体悬浮液与等体积的模拟胃(或肠)液混合，移入酶反应器中，于恒温37℃，恒速150 r/min磁力搅拌的条件下进行释放。在设定的时刻，从中取出0.2 mL样品。测定样品的包封率。用释放率(RR)评估原花青素脂质体的释放情况，累积释放率按式(2)计算。
RR(%)=(1-EEt/EE0)×100 …………………(2)
式中：EE0为原花青素脂质体在0时刻的包封率；
EEt为原花青素脂质体在t时刻的包封率。
2 结果与讨论
2.1 影响脂质体包封率因素的考察
2.1.1 胆固醇与卵磷脂质量比对原花青素脂质体包封率的影响
胆固醇是组成脂质体膜材的重要成分。胆固醇与卵磷脂质量比对包封率的影响如图1所示。
从图1可以看出，随着胆固醇与磷脂质量比从0增加到0.1，包封率逐渐增大，质量比为0.1时，包封率达到最高。当质量比进一步增大，包封率反而出现下降趋势。包封率呈现上述趋势可能是因为：对于水溶性物质，包封率取决于脂质体的内水相体积大小。内水相的增大能够相应地提高包封率[11]。起始阶段脂质体包封率的增加归因于胆固醇能够结合于脂质双分子层膜的松散空间，增强了膜的刚性和致密度。同时胆固醇嵌入脂质体膜使得脂质体颗粒膨大[12]，内水相也相应增大，更多的原花青素被包埋进入内水相，从而包封率增大。但是胆固醇比例过大时，组成脂质体的磷脂的量相对太少，影响脂质体膜形成，另一方面所形成的膜也会变得不牢固，过高的胆固醇使得形成的脂质体膜亲水性太强，膜容易破坏，膜的致密度降低，原花青素很容易渗漏出来。
2.1.2 芯壁比对原花青素脂质体包封率的影响
原花青素与大豆卵磷脂质量比对脂质体包封率的影响如图2所示。
由图2可见，随芯壁比的增加，包封率先增大，后逐渐减小。在芯壁比为0.10时达到最大值60.44%。在芯壁比很低时，由于原花青素浓度很小，脂质体囊泡对原花青素的包封率较低。随着芯壁比的增大，包封率由38.02%增大至60.44%。达最大值后，包封率随芯壁比的进一步增大，却呈下降趋势。这可能是因为在一定条件下，一定的磷脂用量形成的脂质体数量是有限的，也就是说脂质体的包封能力是一定的，故芯材浓度继续增加，包封率反而下降[13]。
2.1.3 吐温80与卵磷脂质量比对原花青素脂质体包封率的影响
吐温80与卵磷脂质量比对包封率的影响如图3所示。
由图3可知，脂质体包封率随吐温80浓度变化趋势是先增大后减小。在吐温80与磷脂质量比为0.5时达到最大64.76%，随着吐温80与磷脂质量比的进一步增加，包封率降低。吐温80是一种非离子型亲水性表面活性剂，能够物理吸附在脂质双层表面，其聚氧乙烯基从脂质双层中伸出，致密覆盖在双层表面，形成有一定厚度的亲水相，增加了膜的有效厚度，将包封物质维持在一个较高的浓度，进而包封率增大[14]。但是吐温80浓度增大到一定程度后，由于它的表面活性剂作用，导致脂质双层的完整性被破坏，引起原花青素泄露。因此，吐温80的量应适中，既能增加膜的有效厚度，又不至于破坏磷脂膜，而利于包封率的增加。
2.1.4 微孔滤膜孔径对原花青素脂质体包封率和平均粒径的影响
微孔滤膜孔径大小影响着脂质体的内水相体积，用不同孔径大小的微孔滤膜挤出5次。孔径大小对脂质体包封率和平均粒径的影响见图4。
从图4可以看出，随着微孔滤膜孔径的减小，挤出所得脂质体的包封率呈下降趋势；同时，脂质体的平均粒径也呈下降趋势。这可能是脂质体本身具有一定的柔性，通过比自身小的孔隙时，会发生形变；但当脂质体通过比自身小的多的孔隙或多次通过小孔隙时，脂质体受到机械力的作用被分成更小的粒子，而在这一过程中脂质体内的芯材容易泄露出来，导致包封率下降[15]。2.1.5 挤出次数对原花青素脂质体包封率和平均粒径的影响 将原花青素脂质体挤压通过孔径为0.2 μm的聚碳酸酯膜，挤压次数对脂质体包封率和平均粒径的影响如图5所示。
图5的结果显示，随着挤压次数的增加，原花青素脂质体的包封率呈下降趋势；同时，脂质体的平均粒径明显变小。当挤出8次时，脂质体平均粒径降低到接近100 nm；而10次时，脂质体的平均粒径降低到100 nm以下；挤压12次脂质体包封率进一步下降，而粒径下降不明显。这可能是随着挤压次数的增加，更多的大粒径脂质体挤压通过滤膜时，被分割成小粒子，一方面降低了粒子粒径，另一方面也引起包封率下降[15]。综合考虑，确定挤压10次降低脂质体粒径。
2.2 原花青素脂质体的体外释放
从图6可以看出，原花青素脂质体在前2 h芯材释放较快，3 h后脂质体的累计释放变化较慢。脂质体在模拟胃液中释放比在模拟肠液中释放要快。这可能是因为胃液环境中有较高浓度的H+，而H+能穿过脂质体的磷脂双分子层，引起双分子层的渗透性增加和脂质体失稳，导致释放率增加[16]。经过10 h释放，在模拟胃肠液中累计释放率分别约为25%和15%。仍有绝大部分芯材包封在脂质体内，因而，脂质体对原花青素有较好的保护效果。
3 ·结论
获得了制备原花青素脂质体的优化处方和工艺条件，即胆固醇与卵磷脂质量比为0.1，原花青素与卵磷脂之比为0.1，吐温80与卵磷脂之比为0.5。将薄膜法制备出的脂质体挤压通过微孔滤膜时，一方面有利于降低脂质体粒径，另一方面也会造成脂质体包封率下降，综合考虑，本研究采用孔径为0.2 μm的滤膜，挤压次数为10次。原花青素脂质体体外释放的结果显示，它有较好的稳定性，脂质体化达到了保护原花青素的效果。采用薄膜-挤压法可制备出粒径小、包封率高、稳定性好的原花青素脂质体，且方法简便易行。