水解酶技术在食品工业中的应用研究进展
随着生物技术的不断发展与进步，生物酶技术在食品工业中的应用也越来越受到重视。酶技术是指在一定的生物反应器内，利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是酶科学在生产实践中的应用; 酶的应用范围已经遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护和生命科学等各个方面［1］。与化学法等传统食品加工方法相比，酶技术不会产生有毒有害物质，可以为食品加工提供更健康、环保、安全有效的解决方案［2］。为了避免酶源命名的混乱以及满足为大量新出现酶命名的需要，国际上采用一个通用的酶命名和分类系统，此系统根据酶所催化的反应类型，将所有的酶分为氧化还原酶( oxido-reductase ) 、转移酶( transferase) 、水解酶( hydrolase) 、裂合酶( lyase) 、异构酶( isomerase) 、连接酶( ligase) 等6 大类［3］。随着酶技术的发展，水解酶在食品工业中得到了广泛的应用。文中分别介绍了水解酶技术在制备食品原辅料、改善食品品质及食品保鲜中的应用及研究进展，分析了存在的问题并对发展趋势进行了展望，旨在促进相关研究以推动水解酶技术在食品工业中的应用和发展。
1 ·水解酶技术在食品工业中的研究现状
1. 1 制备食品原辅料
水解酶能够催化底物的加水分解反应，大部分属于细胞外酶，在生物体内分布最广，数量较多; 水解酶可水解糖苷键、肽键、酯键、醚键、酸苷键及其他C—N键，常见的有糖酶( carbohydrase) 、蛋白酶( protease) 、脂肪酶( lipase) 以及核酸酶( nuclease) ［3］。糖酶、蛋白酶和脂肪酶在生产以及改性糖类、脂类、乳制品、水产品、饮料和药食同源食品等方面具有非常广泛的应用。由表1 可知，不同的酶在制备食品原辅料时具有不同的作用条件，如酶解温度、酶解时间、酶用量以及pH 等，对此，许多研究者选取某种研究方法如单因素试验、正交试验和响应面法等来筛选最适宜的条件，为食品原辅料的酶法工业化生产提供一定的指导。
1. 1. 1 糖酶
糖酶主要用于制备功能性低聚糖( 表1) ，这是因为合成功能性低聚糖的方法一共有5 种: 直接从天然原料中提取、利用酶催化的糖基转移反应进行合成、天然多糖酸水解、化学合成以及天然多糖酶水解［4］。在实际应用中，从天然原料直接提取功能性低聚糖几乎是不可能的，因为它们浓度极低，而且无色、不带电荷，只能使用先进的分离技术进行提取，但成本昂贵，故限制了此法的应用［5］; 多糖酸水解法获得的水解物中糖类组分极其复杂，因此不易控制并获得具有特定结构的功能性低聚糖; 对于化学合成法而言，它需要复杂而冗长的保护和去保护步骤才能达到选择性的控制合成特定低聚糖的目的，而且得率低较低，很难实现低聚糖的规模性生产［6］。而利用酶技术生产功能性低聚糖，无论是酶法水解还是酶法合成，都能在不需要基团保护的温和条件下进行具有立体和区域选择性的反应［6］。从食品工业角度来看，作为一种大量使用的功能性原料，低聚糖的生产成本是一个不可忽视的因素，因此酶法生产功能性低聚糖是一种较理想的方法。
此外，糖酶在啤酒的制备过程中也具有一定的作用( 表1) 。在啤酒生产过程中，高浓度酿造工艺与传统酿造方法相比，可以在不增加糖化和发酵设备的基础上大幅度地提高啤酒的产量［7］，而通过在麦汁煮沸结束前加入部分麦芽糖浆的方法制备高浓麦汁，可以简化麦汁过滤工艺，且不影响麦汁质量［8］。真菌淀粉酶可以从淀粉内部切割α-1，4糖苷键并绕过α-1，6糖苷键继续作用，所以最终糖化液中麦芽糖含量可达50%左右而不会有大分子极限糊精残留［9］。
1. 1. 2 蛋白酶
蛋白酶主要用于水产品深加工( 表1) 。在海洋捕捞中，低值鱼和小杂鱼一直占有较大的比例，随着人们生活水平的提高，二者的直接食用价值越来越低，应用水解酶技术生产浓缩水解鱼蛋白则是水产品综合利用的一条新途径［1］。水解动物蛋白可以作为食品添加剂而用于肉制品、乳制品、保健食品、果奶饮料以及味精中，以达到增强风味及稳定性，提高制品营养价值，延长保质期等目的［10］。除此之外，蛋白酶也可用于贝类产品中制备海鲜调味料，用于虾中制备甲壳素，所以蛋白酶有助于改变水产品加工工业及改进国内现有加工方法，促进水解酶技术在水产品工业中的应用。
1. 1. 3 脂肪酶
由表1可知，用于制备脂类物质的脂肪酶主要是固定化脂肪酶( immobilized lipase) ，脂肪酶的固定化方法与其它酶大致相同，可以分为包埋法、吸附法、共价结合法以及交联法等; 经过固定化的酶，稳定性增加，易于从反应系统中分离且反应条件易于控制，便于运输和贮存，能反复连续使用，有利于自动化生产［11］。脂肪酶使许多脂类物质的制备成为可能，如1，3-特异脂肪酶( 1，3-specific lipase) 具有独特的位点识别功能，可以催化棕榈油与硬脂酸发生反应以提高产物的性能，从而得到与可可脂有相似性质的脂肪［12］; 脂肪酶可以通过酶法酯交换技术将各种植物油用制成人造奶油基料油，不仅能够改善油脂的功能特性，而且可以根据不同人群的需要，在人造奶油中引入特殊脂肪酸，使人造奶油更加营养、健康［13］。
1. 2 改善食品品质
通过在食品加工过程中添加一些种类的酶，可以使产品的颜色、风味、质地以及稳定性得到优化，从而改善食品的品质; 另外，可以采用酶处理一些含有难消化成分的食品，从而改善这类食品的营养和消化利用性能［10］。从目前报道的研究结果来分析，研究人员主要采用单因素及正交试验通过不同的评价指标来优化食品品质改良工艺( 表2) 。
用于改善食品品质的酶主要有糖酶、蛋白酶以及少量的脂肪酶和其他类酶( 表2) 。其中糖酶和脂肪酶均可用于焙烤制品中，通过改善食品的流变特性等性质来提高面团的焙烤性能，但二者作用机理及效果不同。用于改善面团品质的糖酶主要是淀粉酶，其中葡萄糖淀粉酶( glucoamylase) 能将淀粉全部水解为葡萄糖，降低面团发酵时间，改善面包颜色、组织结构与柔软度; 麦芽糖淀粉酶( maltose amylase) 可水解直链淀粉和支链淀粉生成α-麦芽糖和少量糊精，具有抗老化、增加面包柔软度和延长货架期的作用; 由于细菌淀粉酶( bacterial amylase) 可以在焙烤时仍保持较高的酶活，而产生过量的可溶性糊精，致使最终产品发粘，因此要严格控制添加量; 与细菌淀粉酶相反，真菌淀粉酶( fungal amylase) 的热稳定性较差，大部分在淀粉开始糊化前已失活，故对淀粉的作用率较低［29］。
面团中的脂类物质受脂肪酶作用后，能够均匀地包裹住吸水胀大的淀粉颗粒，防止烘烤过程中水分散失;除此之外，因谷蛋白决定面团弹性和粘合性，谷蛋白多时，面团筋力就强，脂肪酶能够通过与甘油三酯作用而阻止其与谷蛋白结合，从而起到增筋作用; 另外，甘油三脂的水解有利于磷脂的形成，使面筋网络增强; 脂肪酶不仅能够提高面团筋力，改善面粉蛋白质流变学特性，还增强面团强度和耐搅拌性，及面包入炉急胀能力，使面包组织细腻均匀、面包芯更柔软、延缓老化［30］。
另外，糖酶和蛋白酶常被用于啤酒生产工艺中，用于改善麦汁的黏度和浊度，提高啤酒的非生物稳定性: 糖酶中的β-葡聚糖酶可作用于β-葡聚糖的β-1，3和1，4糖苷键，使β-葡聚糖分解成还原糖和寡糖; 在糖化阶段加入β-葡聚糖酶可以有效的预防β-葡聚糖浑浊的产生［31］。添加蛋白酶可以改变啤酒中蛋白质的电性或将其分解，使之不与多酚物质结合，能有效地提高啤酒的非生物稳定性，常见的蛋白酶有木瓜蛋白酶( papain) 和生姜蛋白酶( ginger protease) 。生姜蛋白酶是一种硫醇蛋白酶，它可以使啤酒中的大分子蛋白质和蛋白类色素等物质分解为具有较高稳定性且能与考马斯亮蓝呈色的多肽和氨基酸等物质，从而提高啤酒的澄清度［32］。木瓜蛋白酶是从番木瓜果汁中提取出来的一种纯天然的蛋白酶，具有活性强、稳定性好、耐高温、对pH 和金属离子浓度变化不明显等特点［33］。将木瓜蛋白酶用于冷冻贮藏的啤酒中，可水解啤酒中的蛋白质和一些已经形成的复合物，在生成大量的多肽或氨基酸的同时，保证啤酒澄清度，改善啤酒口感，提高啤酒营养价值［32］。
1. 3 水解酶技术在食品保鲜中的应用
现有的食品保鲜技术主要有冷藏、气调保藏和辐射保藏等方法，但这些方法设备昂贵、成本高; 而利用自然冷资源进行保鲜虽然可以有效地降低成本，但受到地理位置的限制，尚未得到大面积的应用［46］; 利用化学保鲜剂对食品进行保鲜会造成较多的化学物质残留，因此寻找一种既经济又安全的保鲜方法是研究者们面临的一大课题。酶制剂本身无毒、无味、无臭［47］，将其作为食品添加剂应用于食品保鲜中，可以大大的提高食品的安全性。应用于食品保鲜中的水解酶主要是溶菌酶以及部分的异淀粉酶和脂肪酶。
1. 3. 1 溶菌酶在食品保鲜中的应用
溶菌酶( EC3. 2. 1. 17) 是一种食品级抑菌酶，在控制食品腐败菌方面具有的独特的作用，对革兰氏阳性菌作用最为明显; 溶菌酶具有广泛的的pH 和温度耐受范围，因此可以作为一种安全的食品防腐剂应用于食品保鲜中［48］。从目前报道的研究结果来看，溶菌酶主要用于肉制品、水产品以及乳制品的食品保鲜中，研究人员采用的研究方法主要是单因素及正交试验，并通过感官特性、微生物指标、挥发性盐基氮( TVB-N) 、硫代巴比妥酸含量( TBA) 以及pH 等指标来优化保鲜工艺( 表3) 。
1. 3. 2 异淀粉酶在食品保鲜中的应用
异淀粉酶( EC3. 2. 1. 68) 能够专一性的分解糖原及支链淀粉中处于支叉地位的α-1，6糖苷键，从而形成直链淀粉和寡聚糖［68］。直链淀粉易凝结成块而形成结构稳定的凝胶物质，常以薄膜的形式应用于食品保鲜，这种薄膜对氧气和油脂有良好的阻隔性，且涂布性好，适于作为产品的保护层［69］。朱香云［70］用异淀粉酶处理成膜基质淀粉，在与对照组厚度相同的条件下，拉伸强度减少80. 81%，断裂伸长率和醛基含量分别增加了1210. 66%和0. 442 mol /g。因此，将异淀粉酶应用于以淀粉为成膜基质的食品保鲜膜的生产是可行的。
1. 3. 3 脂肪酶在食品保鲜中的应用
脂肪酶( EC3. 1. 3. 3) 在动植物组织及微生物中普遍存在，是最早研究的两类酶之一，至今已有上百年的历史，按底物专一性可分为非专一性脂肪酶( non-specific lipase) 、1，3-专一性脂肪酶( 1，3-specificlipase) 、脂肪酸专一性脂肪酶( fatty acid-specific lipase)三类，可催化酯化、转酯、酯交换及对映体拆分等化学反应［71］。目前脂肪酶已经广泛地用于制备油脂和改善面团焙烤品质等食品加工中，而在食品保鲜方面脂肪酶主要用于水产品以及焙烤制品的保鲜中。海洋中的中上层鱼类，如鲭鱼、鲐鱼等，由于脂肪含量较高的，因此在保鲜、加工和销售过程中极易发生腐败变质，而脂肪酶可以对这些鱼进行部分脱脂，延长鱼产品的贮藏期［72］。福建师范大学研制的脱脂鳍鱼片和宁波大学开发的脱脂大黄鱼等，均是水解鱼中的部分脂肪，从而达到延长鱼类产品贮藏期的目的［73］。在生面团中加入脂肪酶可以水解部分三甘酯，达到增加单甘酯含量，延长面包保质期的作用［71］。另外，面包在贮藏过程会由于老化而导致食用品质下降，面包的老化机理极其复杂，目前主要有三种推理: 淀粉重结晶、面包内水分迁移损失以及蛋白质与淀粉的相互作用［74］。张峦［74］采用一种新型重组华根霉脂肪酶( Ｒhizopus chinensis lipase，ＲCL) 处理面团，通过测量面包芯硬度的变化以及面包内淀粉重结晶的程度来研究面包的老化情况，TPA 和DSC 实验表明，ＲCL 能够显著降低面包的老化速度，具有较好的抗老化效果。
2 ·水解酶技术在食品工业应用中存在的问题及解决方法探讨
综上所述，水解酶技术已经给食品工业带来了极大的革新和进步，许多食品方面的难题都因水解酶技术的应用而得到了解决，但由于酶是由活细胞产生的具有催化能力的活性成分，因此由于各种因素的限制而使其在实际应用中存在一定的困难。
2. 1 不易回收且难于实现连续化、自动化生产
自由酶反应通常在溶液中进行，反应后残留在溶液系统中而难以实现最终产品的生化分离提纯操作;另外，自由酶反应只能分批进行，难于实现连续化、自动化操作，这极大地阻碍了水解酶技术的发展与应用; 而将酶固定在特定的载体上可以限制酶的运动，便于将酶从反应系统中回收及进行连续化自动化操作［75］; 但由于酶要经过分离、固定化等处理，因此固定化酶也具有一些缺陷: ( 1) 在固定化过程中，酶活力会损失，其中胞内酶在预分离过程中损失较大;( 2) 成本高，初期投资大; ( 3) 应用范围较窄，只能用于水溶性底物，特别是小分子底物，大分子底物基本无法进行反应; ( 4) 不适用于多酶反应，部分酶还需要辅助因子协助才可以使反应有效进行; 因此当开发新的固定化酶工艺时，要考虑酶的成本及稳定性、载体的价格、固定化工艺及下游工程，当采用固定化酶工艺总体效果优于化学工艺时，可以考虑使用前者［76］。
2. 2 稳定性差
绝大多数酶的化学本质都是蛋白质，其最大的缺点就是不稳定，分为化学不稳定和物理不稳定两种形式; 其中化学不稳定是由于氨基酸残基的修饰或变化引起的，物理不稳定主要涉及由酸、碱、热及有机溶剂引起的蛋白质的二级、三级和四级结构的变化［77］。
而酶经过固定化后稳定性一般均有所提高，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低，对温度和pH 适应范围增大［75］。我们也可以在具有较高稳定性的物质中提取控制稳定性的基因，并通过基因工程技术开发出具有较高稳定性的酶; 另外，极端酶对物理不稳定性因素也具有较高的耐受能力。
2. 3 基础研究不足
水解酶技术对操作条件要求严格，为使水解酶在工业化生产中发挥最大作用，必须综合考虑酶的浓度、温度、pH、作用时间、底物浓度等因素的影响; 同时，某些物质能够作为激活剂使酶的活性增强，某些物质能够作为抑制剂使酶的活性降低; 例如，氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为该酶的抑制剂; 但激活剂与抑制剂并不是绝对的，某些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，在高浓度时反而成为该酶的抑制剂，例如氯化钠达到1 /3 饱和浓度时则为唾液淀粉酶的抑制剂［78］。因此，我们应加强对生产所需酶基础理论的研究，对于开发新酶种、菌种选育、提高酶活、确立有利于降低成本的工艺条件等核心技术体系进行进一步完善。
3· 水解酶在食品领域中的发展前景与趋势
酶技术是一种源于自然界自身的技术，它在食品工业中的应用已经充分反映了21 世纪食品添加剂与食品工业发展的新趋势。随着基因工程等新技术的发展，酶工程应用潜力有望进一步发挥［2］。
3. 1 深入研究开发极端酶，扩大水解酶在食品工业中的应用范围
在食品工业中存在着很多的极端环境，如高温、强酸、强碱以及高渗等，普通酶的活力在这样的环境中通常会降低甚至丧失，因此开发出能在极端环境下起生物催化作用的酶是人们一直以来需要解决的问题［79］。极端酶( extremozymes) 主要来源于嗜极菌( extremophiles) ，是这类微生物生存和繁衍的基础，它能耐受食品生产过程中的一些“极端”条件，发挥一般生物酶所不具备的催化特性［72］。如嗜热酶( thermophile enzymes) 克服了中温酶及低温酶在反应过程中出现的不稳定现象，从而使许多化学反应在高温下能够高效稳定地进行［80］。极端酶的研究，极大地拓宽了人们对酶特性的认识和生物催化剂的应用范围。但是极端酶的结构、功能与稳定机制之间的关系尚不清楚，随着研究的深入及DNA 重组技术的利用，相信极端酶的开发和应用将会出现诱人的前景。
3. 2 水解酶技术与基因工程技术相结合
应用基因工程技术创造高活性的新酶源是水解酶技术发展的一个趋势。DNA 重组技术对酶工业的渗透，导致了酶工业的迅速发展: 纤维素酶的基因克隆始于1970 年左右，迄今为止，已经报道和公布了7000 多个纤维素酶基因序列和相应的氨基酸，这其中有500 多个纤维素酶的3D 结构被预测［81］; 通过基因工程合成的水生动物重组溶菌酶不仅能够溶解常见的革兰氏阳性细菌，还能够溶解经常引起水产动物严重病害的革兰氏阴性菌，因此可以将重组海参溶菌酶应用于水生动物病害的防治及提高自身的免疫力［82］。酶的体外定向进化( 实验分子进化，experimentallymolecular evolution) ，是通过易错PCＲ、DNA等改组方法，在酶结构和功能未知的条件下模拟自然进化过程，对酶基因进行随机诱变、重组，最终筛选出合理的突变酶的一种方法，该技术能够提高酶的催化能力、抗热性以及稳定性［83］。这方面的工作值得更多的投入，与之配套的反应模型和快速检测方法的建立是重要的环节。为了更好地利用自然界中丰富的水解酶资源，人们对水解酶的基因工程研究还在继续。相信在不远的将来，会有大量的水解酶基因被克隆，更先进的基因操作技术将被发明。
3. 3 改进水解酶的加工技术
除水解酶种类的开发外，在酶的加工技术方面也期望有新的突破。在酶的加工反应中，为了使水解酶能够充分发挥它的催化能力，可以采用一些新的处理方法: ( 1) 加速固定化酶技术的研究与应用，提高固定化酶的再生活性; ( 2) 深入研究酶制剂胶囊化技术，尽可能保持酶活性的稳定; ( 3) 利用基因工程对受体酶DNA 核苷酸序列进行重新编码，获取活性高、热稳定性好、pH 适用范围广的新酶源［84］。同时，水解酶新型反应体系及相关生物反应器的建立与研究同样是水解酶技术面向产业化的重要课题。随着水解酶加工技术的不断改进与发展，水解酶在食品工业中的应用潜力将有望进一步发挥。