粟 敏， 谢达平， 李 帅
（湖南农业大学生物科学技术学院生物工程系，长沙 410128）
摘 要：本实验通过研究红酵母色素的光稳定性、热稳定性、储存时的最适pH值、山梨酸钾对其保存的作用以及红酵母色素的抗氧化性质，得出以下结论：红酵母色素的热稳定性和光稳定性较差，红酵母色素保存的最适pH值在6.0左右，保存时添加一定浓度的山梨酸钾对防止其氧化有一定作用。红酵母色素对3种氧自由基都有清除作用，其中清除O2-的能力最强，清除·OH的能力次之，清除H2O2的能力最弱。
关键词：红酵母色素；β-胡萝卜素；稳定性；抗氧化性；自由基
类胡萝卜素是广泛存在于自然界的一大类色素，其在人类生活、保健、医疗上的重要性逐渐为人们所认识。以β-胡萝卜素为代表，可作为食品添加剂和营养强化剂，另外，其出色的抗氧化功能也被研究所证明。红酵母可产生红酵母红素、β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素等多种类胡萝卜素。本实验所用红酵母是从福建红酒的酒曲中分离出来的，安全性较高，我们对这株红酵母所产色素的稳定性行了初步研究，并利用微弱化学发光法检测了红酵母色素清除氧自由基的能力，为红酵母产品的进一步开发利用提供了科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 红酵母菌株，从福建红酒酒曲中分离，由湖南农业大学生科院实验室保存。
1.1.2 仪器 微弱化学发光仪、7220分光光度计、恒温水浴锅、霉菌培养箱、自动台式灭菌锅、超净工作台等。
1.1.3 试剂 鲁米诺（色谱纯）：苏州工业园区亚科化学试剂有限公司；邻苯三酚（分析纯）：Sigma；1,10-菲啉（分析纯）：天津市化学试剂研究所；抗坏血酸：北京鼎国生物技术有限责任公司；过氧化氢：中国医药（集团）上海化学试剂公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.4 培养基 马铃薯斜面培养基中，种子培养基：葡萄糖1％、蛋白冻0.5％、麦芽汁0.3％、pH自然。大米半合成培养基：大米5g、葡萄糖0.2g、水20ml、pH自然。
1.2 方法
1.2.1 红酵母色素样品的制备 将培养3～5d的红酵母发酵产物进行冷冻干燥，加入丙酮，20℃超声波破碎30min，离心取上清，减压浓缩，冷冻干燥，得色素粗制品，配成一定浓度的色素溶液。
1.2.2 光对红酵母色素稳定性影响 将10ml不同浓度的红酵母色素样品置于光照培养箱中分别光照0～12h，稀释到相同初始浓度，比色法检测光照后色素变化情况。
1.2.3 热对红酵母色素稳定性影响 将10ml同浓度的红酵母色素样品分别置于0～100℃水域保温0~12h，450nm下比色，检测保温后色素变化情况。
1.2.4 防腐剂对红酵母色素稳定性影响 在10ml某浓度的色素样品液中加入不同浓度（0～4％）的山梨酸钾溶液1ml，每小时取一次样，于450nm下比色，检测色素变化情况。
1.2.5 pH值对红酵母色素稳定性影响 分别调不同pH（3.0～10.83）的碳酸缓冲液和柠檬酸缓冲液，每20ml缓冲液称入色素样品0.01g，常温下避光保存24h，450nm下比色，检测色素变化情况。
1.2.6 红酵母色素清除自由基能力的研究
（1）红酵母色素清除O2-的测定方法
在样品池中加入一定浓度的红酵母色素提取液（以溶剂做空白对照），然后加入1mmol/L的邻苯二酚10μl、鲁米诺-碳酸缓冲液940μl，充分混匀后，立即启动化学发光反应，记录30s内化学发光动力学曲线。
（2）红酵母色素清除·OH的测定方法
在样品池中加入一定浓度的红酵母色素提取液，然后加入50μl CuSO4溶液、50μl 1,10-菲啉容液、700μl硼酸-硼砂缓冲液，充分混匀，然后加入100μl抗坏血酸溶液和50μl H2O2溶液，立即启动化学发光反应，记录240s内化学发光动力学曲线。
（3）红酵母色素清除H2O2的测定方法
在样品池中加入一定浓度的红酵母色素提取液，然后加入50μl H2O2溶液、900μl鲁米诺-碳酸缓冲液，充分混匀后立，即启动化学发光反应，记录60s内化学发光动力学曲线。
（4）红酵母色素清除氧自由基能力评价
用生物化学发光法测定氧自由基清除作用时，一定浓度范围内的发光强度（CL）与氧自由基数量呈量效关系，因此我们用CL表示氧自由基的相对产生量。而清除氧自由基的物质可以降低CL，根据CL的下降则可以判断某物质清除氧自由基的能力。
发光抑制率（％）＝（CL（空白对照）－CL（样品））/CL（空白对照）×100％
以发光抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制发光抑制曲线。一般用发光抑制率为50％时的浓度IC50来衡量样品对氧自由基的清除能力。IC50值越小，表明其清除氧自由基的能力越强，反之，IC50值越大，表明其清除氧自由基的能力越弱。
2 结果与分析
2.1 光对红酵母色素稳定性的影响
以上试验数据说明：红酵母色素的光稳定性较差，随着光照时间的延长，色素逐渐被氧化。且在相同光照条件下，色素浓度越低越容易被氧化。见图1。
2.2 热对红酵母色素稳定性的影响
实验数据说明：红酵母色素的热稳定性较差，随着加热时间的延长，色素逐渐被氧化，且相同浓度的色素样品在相同时间内，储存温度越高越易被氧化。结果见图2。
2.3 防腐剂对红酵母色素稳定性的影响
实验数据说明：防腐剂山梨酸钾在色素短期保存时，对防止色素氧化有一定的作用，且山梨酸钾的浓度越高越利于色素的保存（见图3）。
2.4 pH值对红酵母色素稳定性的影响
实验数据说明：红酵母色素在不同pH值下保存时其稳定性不同，其在弱酸性和中性条件下较稳定，而在强酸和碱性环境下稳定性较差（见图4）。
2.5 红酵母色素清除自由基能力的研究
本实验所用到的红酵母色素提取物对3种主要的氧自由基均有不同程度的清除作用，并有明显的数量效应（表1～3）。该红酵母色素提取物清除O2-、·OH和H2O2自由基的IC50分别为7.88mg/ml、20.61mg/ml和38.85mg/ml（表4）。说明其清除O2-的能力最强，清除·OH的能力次之，清除H2O2的能力最弱。
表1 不同浓度红酵母色素提取物清除O2-的能力
浓度（mg.ml-1） 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
发光抑制率（％） 9.0 23.0 39.8 52.7 62.2
表2 不同浓度红酵母色素提取物清除·OH的能力
浓度（mg.ml-1） 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
发光抑制率（％） 4.1 17.5 31.5 44.8 57.1
表3 不同浓度红酵母色素提取物清除H2O2的能力
浓度（mg.ml-1） 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0
发光抑制率（％） 11.0 23.0 40.0 54.1 69.0
表4 红酵母色素提取物清除各种自由基的能力
自由基类型 O2- ·OH H2O2
IC50（mg.ml-1） 7.88 20.61 38.85
以发光强度为纵坐标，发光时间为横坐标记录各个发光动力学曲线（图5～7）。从图中可以看出，红酵母色素提取物可以使发光曲线发生明显变化，主要表现为发光峰值和发光曲线面积的降低。该试验结果表明：红酵母色素提取物有很强的清除氧自由基（O2-、·OH和H2O2）的能力，显示了强氧化性。
3 讨论
对红酵母色素性质的研究表明，红酵母色素的热稳定性和光稳定性较差，红酵母色素保存的最适pH值在6.0左右，保存时添加一定浓度的山梨酸钾对防止其氧化有一定作用。通过红酵母色素清除各种氧自由基的试验发现，其对3种氧自由基都有清除作用，其中清除O2-的能力最强，清除·OH的能力次之，清除H2O2的能力最弱。与VE相比红酵母色素有较强的抗氧化性，这对今后红酵母色素产品的研发提供了一定的参考。◇
参考文献
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［3］高蓝,李浩明.类胡萝卜素与癌症的化学预防.中草药，1998,29(5):346-348.
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作者简介：粟敏（1983～ ），湖南长沙人，硕士研究生，研究方向为酶工程与发酵工程，主要从事酵母色素的研究工作。