食品防腐剂焦亚硫酸钠生物毒性研究
张榕欣
(茂名职业技术学院,广东茂名)
摘要:为了直接可视化观察焦亚硫酸钠(SM)与红细胞作用后形态上的变化以及对细胞膜分子形貌的影响,利用纳米分辨率 水平的原子力显微镜对经不同SM浓度的红细胞表面进行扫描观察。结果表明:与正常红细胞相比,经SM作用后的红细胞 的高度明显降低,凹陷部分更加明显;对红细胞上小范围扫描成像的结果显示,受损后的红细胞膜表面结构发生了变化,膜 表面颗粒排列的特征依然存在,但颗粒之间开始产生连接并团聚;SM具有生物毒性,能损伤红细胞膜,改变细胞膜的微结 构,引起红细胞的溶血作用。
关键词:焦亚硫酸钠;红细胞;原子力显微镜
在我国食品工业中,焦亚硫酸钠(sodium metabisulphite,SM)广泛应用于食品和饮料中作为漂白剂、防 腐剂、疏松剂、抗氧化剂、护色剂及保鲜剂。多年来世界上大多数国家一直允许其作为食品防腐剂,但最近 有报道指出,焦亚硫酸钠作为食品防腐剂可能诱发支气管哮喘[1,2],过敏反应[3],其在食品添加剂中残留的 SO2与肿瘤发生也有一定的相关性[4,5]。焦亚硫酸钠杀伤细胞,首先作用的是细胞膜,但是目前在国内外 还没有在纳米水平上分析报道SM对红细胞损伤的形态变化以及超微结构影响的研究报道。
自1986年Binning[6]等人发明原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)以来,AFM一直用于样品表 面形态结构的观察,它是通过探测针尖和样品之间的相互作用力,获得样品表面空间结构的信息,最高分 辨率可达到原子级。由于AFM是利用针尖与样品的微小的作用力来工作的,因此有着样品制备简单、对 样品破坏小等优点,特别适用于不导电的生物样品的研究。近年来,科学家利用AFM进行生物研究,取得 了显著的成果。AFM已经成为研究生物化学过程、细胞表面结构以及生物高分子聚合物的有力工具。
本文利用AFM研究焦亚硫酸钠与红细胞的作用,直接观察到了单个红细胞整体形态上的变化;利用 AFM的高分辩率,在纳米范围内观察到了细胞膜表面微结构的变化。
1 材料和方法
1.1 材料
红细胞是从新鲜血样经离心分离而得,用PBS缓冲溶液稀释10倍。焦亚硫酸钠购自佛山双氟化工有 限公司。其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1)焦亚硫酸钠与红细胞的作用。取红细胞缓冲溶液150μL,分别加入50μL质量比为0.1%、0.2%、0.3% 的焦亚硫酸钠溶液,充分混合后在35℃温度下作用12h。
2) AFM观察用样品的制备及成像。用微量移液器移取10μL红细胞-焦亚硫酸钠混合液滴于干净的 盖玻片表面,再滴加20μL2.5%戊二醛溶液固定5min。用滤纸从盖玻片的边缘将多余的溶液吸去,用三次 蒸馏水洗涤3次,以消除盐份的干扰。样品在空气中自然风干后,用于AFM观察。成像使用的AFM为美 国THERMOMICROSCOPE仪器公司生产的AutoprobeCPResearch型原子力显微镜。所有图像只经过系统自带的自动平滑处理(Flatten Auto),以消除慢扫描方向上的低频噪音。
2 结果和讨论
与焦亚硫酸钠作用前后红细胞样品的AFM图像如图1所示。图1(a)为一个完整细胞的形貌图,图1 (a1)为其高度曲线图。从图中可以看出,红细胞的整体轮廓呈双面凹陷的扁圆盘形状。正常红细胞凸出 部分平均高度为1.2~1.5μm,直径为7~9μm。在未加入焦亚硫酸钠的红细胞样品的对照实验中,单个红 细胞的形态以及细胞膜表面结构在12h内没有随时间发生明显的变化。图2(b)是作用12h后的受损红细 胞的形貌图,图2(b1)是其高度曲线图。与焦亚硫酸钠作用12h后,受损红细胞的高度降到了180nm,细胞 中央的凹陷更加明显。
以上结果表明,焦亚硫酸钠引起了红细胞产生的溶血作用,溶血后的红细胞在外形上仍保持红细胞特 有的双面凹的特征,细胞膜表面无明显的破裂,只是细胞的高度、体积等变小。这说明红细胞的溶血作用 不是因为物理性作用造成细胞膜破裂而引起的,而是焦亚硫酸钠对细胞膜产生了损伤作用,增大了细胞膜 的通透性,细胞内容物外泄的结果。
对经焦亚硫酸钠作用12h前后的红细胞表面小范围进行扫描获得了其超微结构图象。如图2(a)是在 纳米范围内对正常红细胞膜表面局部区域的成像。可以清楚地看到,正常红细胞膜表面表面较为平滑,其 膜表面的颗粒直径为10~20nm,多以圆形或卵圆形为主,推断这些颗粒应主要是红细胞膜蛋白分子暴露 于膜表面的部分。图2 (b)是与焦亚硫酸钠作用12h后受损红细胞上小范围成像的形貌图。与图2(a)比 较,可以看出细胞膜表面起伏增大, 红细胞表面出现的颗粒大小不一、 分布紊乱、凹凸粗糙,平均直径为 100nm。这些特征不仅揭示了焦亚 硫酸钠引起红细胞膜分子结构改变 中蛋白分子形貌学表象。颗粒状物 质可能是各种膜外周蛋白,凹陷区 域对应于细胞膜的脂质区[7]。
同时,AFM观察到经过与不同 浓度焦亚硫酸钠作用后的红细胞其 细胞膜出现了不同程度的损伤情 况,验证了随着浓度的增加,焦亚硫 酸钠对红细胞的膜损伤越来越严 重,红细胞膜表面粗糙度不断增加, 如图3所示。
3 结论
通过利用高分辨率的AFM对焦亚硫酸钠损伤的红细胞膜表面分子形貌学变化特征的观察可知,焦亚 硫酸钠具有一定的生物毒性,并且其毒性随使用浓度的增加而增加。因此我们在选用这一食品防腐剂时 应该注意其使用量的标准。
参考文献：（略） （食品添加剂应用网）